Perfil inmunológico de ratones inmunizados con un virosoma polivalente.

Revista de Virología volumen 20, Número de artículo: 187 (2023) Citar este artículo

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El virus de la influenza A (IAV) causa enfermedades respiratorias en los cerdos y es una gran preocupación para la salud pública. La vacunación de los cerdos es la medida más exitosa para mitigar el impacto de la enfermedad en las piaras. El virosoma a base de influenza es un portador inmunomodulador eficaz que replica la vía natural de presentación del antígeno y tiene un perfil de tolerabilidad debido a su pureza y biocompatibilidad.

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar una vacuna polivalente contra la influenza virosoma que contenga las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa derivadas de los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 de los IAV porcinos (swIAV), e investigar su eficacia en ratones como una posible vacuna para los cerdos. Los ratones fueron inmunizados con dos dosis de vacuna (1 y 15 días), por vía intramuscular e intranasal. A los 21 días y ocho meses después de la segunda dosis de la vacuna, se practicó la eutanasia a los ratones. Se investigaron las respuestas inmunes humorales y celulares en ratones vacunados por vía intranasal o intramuscular con una vacuna virosomal polivalente contra la influenza.

Sólo la vacunación intramuscular indujo títulos elevados de inhibición de la hemaglutinación (HI). La seroconversión y la seroprotección (aumento > 4 veces en los títulos de anticuerpos HI, alcanzando un título ≥ 1:40) se lograron en el 80 % de los ratones (grupo vacunado por vía intramuscular) 21 días después de la inmunización de refuerzo. Se detectaron títulos de anticuerpos neutralizantes del virus contra el VIA ocho meses después de la vacunación, lo que indica una inmunidad duradera. En general, los ratones inmunizados con el virosoma mostraron una mayor capacidad de las células B, T efectoras y T de memoria del bazo para responder a los antígenos H1N1, H1N2 y H3N2.

Todos los hallazgos mostraron una respuesta inmune eficiente contra los IAV en ratones vacunados con una vacuna contra la influenza polivalente basada en virosomas.

El virus de la influenza pandémica H1N1 de 2009 (H1N1pdm09) ilustra claramente el potencial de los virus de la influenza A (IAV) para causar morbilidad y mortalidad en la población humana a escala global, así como la importancia de los cerdos en la evolución de los virus zoonóticos [1]. . Los cerdos son susceptibles a la infección por VIA aviares y humanos y, por lo tanto, pueden servir como “recipiente de mezcla” para la aparición de nuevos virus mediante la recombinación de segmentos de genes de la influenza [2]. El VIA es endémico en cerdos en todo el mundo, con múltiples linajes de virus genética y antigénicamente distintos de los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 que circulan en diferentes regiones geográficas [3, 4]. Clínicamente, la infección por el virus de la influenza causa una enfermedad respiratoria aguda caracterizada por fiebre, letargo, tos, anorexia y secreción nasal. El IAV altera el sistema de defensa normal del tracto respiratorio y puede provocar infecciones bacterianas secundarias [5].

La medida más eficaz para mitigar y controlar la morbilidad y mortalidad asociada al VIA en poblaciones porcinas es la vacunación. La vacunación contra la influenza porcina es igualmente crucial para la salud humana, ya que reduce la transmisión del IAV de cerdo a humano y de humano a cerdo, disminuyendo la probabilidad de riesgos pandémicos y la aparición de nuevas cepas [2, 6]. En Brasil, la vacuna comercial IAV para cerdos actualmente autorizada se basa en el virus H1N1pdm09 (WIV) completamente inactivado. La protección lograda por esta vacuna está mediada principalmente por la inducción de anticuerpos dirigidos a las glicoproteínas virales hemaglutinina (HA) y, en menor medida, neuraminidasa (NA) [7, 8]. Sin embargo, para una vacuna altamente eficaz, los antígenos de la vacuna deben tener una estrecha coincidencia antigénica con los VIA circulantes en las piaras de cerdos [9, 10].

La vigilancia del VIA en cerdos mediante caracterización genética y antigénica es de suma importancia para la selección de candidatos vacunales. Recientemente, se ha encontrado una gran diversidad genética de VIA en la población porcina brasileña, lo que puede tener implicaciones para el diseño de vacunas de protección cruzada [11]. En este sentido, las vacunas contra el VIA porcino disponibles en el país podrían proporcionar una protección limitada o nula contra los VIA porcinos genéticamente distintos que circulan actualmente. Además, los IAV tienen la capacidad de evadir la respuesta inmune del huésped a través de mecanismos conocidos como deriva antigénica y cambio antigénico, que requieren una actualización periódica de los virus que componen la vacuna para que coincidan con los virus circulantes [12].

En los últimos años se han realizado varios estudios con el objetivo de desarrollar vacunas ampliamente protectoras que induzcan respuestas inmunes tanto humorales [13, 14] como celulares [3, 7, 15,16,17]. En general, estas vacunas se dirigen a epítopos conservados antigénicamente en la HA [18,19,20], expresados ​​por una partícula similar a un virus (VLP) [21]. Sin embargo, ninguna de las soluciones propuestas ha producido una vacuna práctica que induzca una protección heterosubtípica amplia o logre la inmunidad esterilizante deseada. Se puede lograr una amplia protección contra los IAV con vacunas polivalentes de inmunógenos mixtos de subtipos específicos o con el uso de un buen inmunógeno conservado entre los subtipos de IAV circulantes [8]. Una vacuna polivalente contra la influenza podría disminuir las limitaciones inherentes de las vacunas contra la influenza porque están diseñadas para proteger contra diferentes virus de la influenza que circulan en las piaras de cerdos [17, 22]. Además, para lograr una inmunidad eficaz mediante la inmunización, el objetivo de los anticuerpos neutralizantes del virus debe coincidir antigénicamente con los IAV circulantes, que en los cerdos consisten en aislados de distintos linajes de los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 [23, 24].

Los virosomas son VLP producidas in vitro a partir de componentes de la envoltura purificados; sin embargo, carecen del material genético y proteínas internas del virus nativo. Los virosomas de la influenza combinan los beneficios técnicos de una composición bien regulada con las ventajas inmunológicas de las VLP [25]. Incorporadas dentro de la bicapa de fosfolípidos de los virosomas se encuentran las glicoproteínas funcionales de la envoltura del IAV, HA y NA. Estas proteínas virales no sólo ofrecen estabilidad estructural y homogeneidad a las formulaciones virosomales, sino que también contribuyen significativamente a las características inmunológicas de los virosomas, que los distinguen de otros sistemas liposomales [26]. La actividad de fusión completamente funcional de los virosomas que contienen la proteína HA permite la captación mediada por receptores y el procesamiento intracelular natural del antígeno, desencadenando así respuestas inmunes tanto humorales como celulares [27]. En este estudio, se construyó una vacuna virosomal trivalente swIAV basada en los virus H1N1pdm, H1N2 y H3N2 utilizando un fosfolípido de cadena corta dializable (1,2-Dicaproyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DCPC) como agente solubilizante, ya que este surfactante presenta el mejor desempeño para la solubilización viral; Mantiene la funcionalidad de las proteínas de la envoltura y se elimina completamente mediante diálisis durante la producción de virosomas [28]. Además, la eficacia de los virosomas se demostró en ratones midiendo la respuesta inmune celular y la respuesta de anticuerpos séricos contra las cepas de la vacuna IAV.

Se seleccionaron tres IAV aislados de cerdos para la preparación de la vacuna contra la influenza: A/swine/Brazil/025 − 15/2015 1 A.3.3.2 (H1N1pdm; NCBI GenBank Accession HA = MH559931 y NA = MH559933; BRMSA 1710), A/swine/Brazil/223-15-1/2015 1B.2.4 (H1N2; NCBI GenBank Accession HA = MH560035 y NA = MH560037; BRMSA 1698) y A/swine/Brazil/028-15-8/2015 (H3N2; Acceso a NCBI GenBank HA = MH559963 y NA = MH559965; BRMSA 1697). Las muestras virales H1N1 y H1N2 se propagaron en huevos de gallina embrionados SPF (libres de patógenos específicos) y el virus H3N2 se inoculó en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK; BCRJ), según Zhang y Gauger [29]. Para confirmar la presencia de IAV, el sobrenadante de células y el líquido corioalantoideo extraído de los huevos se analizaron mediante un ensayo de hemaglutinación [30] y mediante RT-qPCR [31].

Aproximadamente 1 litro de cada virus se concentró individualmente mediante ultrafiltración tangencial utilizando una bomba de flujo acoplada a un casete que contenía una membrana de diálisis que consistía en polietersulfona (PES) con un límite de 100 kDa (sistema Vivaflow 200, Sartorius, Alemania). Luego, se ultracentrifugaron 50 ml de cada concentrado viral a 100.000 xg durante 4 h a 4 °C (Optima LE 80 K, Beckman Coulter, EE. UU.). Se descargaron los sobrenadantes y los sedimentos de cada virus se diluyeron hasta un volumen final de 5 ml en tampón TNE (Tris 10 mM, NaCl 100 mM y EDTA 1 mM, pH 7,4). Los virus concentrados se titularon mediante un ensayo de hemaglutinación [30] y el contenido de hemaglutinina se determinó mediante SDS-PAGE (NuPAGE™ Bis-Tris, Thermo Fisher, EE. UU.) usando una placa de gel de acrilamida (4-12%) y tinción con plata de acuerdo con el recomendaciones del fabricante. La concentración de HA se calculó a partir de la intensidad de las bandas (obtenida con el software ImageJ) utilizando una ecuación obtenida a partir de una curva de calibración estándar de albúmina.

El virosoma multivalente se preparó según de Jonge, Leenhouts [32] con modificaciones. Brevemente, se mezcló el mismo volumen de cada virus (1:1:1) y se diluyó en una solución 200 mM de 1,2-dicaproil-sn-glicero-3-fosfocolina (DCPC, Avanti Polar Lipids, EE. UU.). Después de una suave homogeneización, los virus combinados se diluyeron aún más 1:2 (v/v) en el tampón TNE y la mezcla final se mantuvo en un baño de hielo durante 30 minutos para asegurar la disolución de las envolturas virales. Posteriormente, la mezcla se ultracentrifugó a 100.000 xg durante 30 min a 4 °C para eliminar las nucleocápsides virales. El sobrenadante se dializó extensamente en un tubo de diálisis de celulosa (corte de 10 kDa, SpectraPor, EE. UU.) contra tampón TNE durante 48 h a 4 °C para eliminar el surfactante (DCPC), lo que condujo al autoensamblaje de las vesículas del virosoma. . Posteriormente, se determinaron las características físico-químicas de la formulación de virosoma dializado, midiendo el tamaño de partícula y el potencial zeta mediante dispersión dinámica de láser y electroforesis láser Doppler (Zetasizer, Malvern). El contenido de antígeno HA de H1N1, H1N2 y H3N2 se determinó mediante SDS-PAGE.

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para examinar la morfología y ultraestructura de los virosomas utilizando el microscopio JEOL JEM-1011 (Jeol, Japón). Las muestras se utilizaron puras o diluidas al 50% en agua ultrapura. Antes del análisis, se depositaron 3 µL de suspensión de virosomas en una rejilla de cobre cubierta con Formvar®. Las rejillas de cobre se fijaron y después de su completo secado se contrastaron con vapor de Tetróxido de Osmio al 1%. Así, se colocaron 40 µL de tetróxido de osmio en el fondo de una placa de Petri que contenía las rejillas de cobre durante 40 min. Los virosomas se digitalizaron utilizando una cámara UltraScan® conectada al software informático Digital Micrograph 3.6.5® (Gatan, EE. UU.). Para eliminar cualquier duda sobre qué eran virosomas y qué eran artefactos del contraste con tetróxido de osmio al 1%, se creó un control negativo durante el análisis que utilizó solo agua ultrapura y tetróxido de osmio [33].

Para evaluar la infectividad del virosoma, se inoculó en huevos de gallina embrionados y se incubó a 37 °C durante 4 días. También se inoculó virosoma en células MDCK y se controló durante 7 días.

Para los ensayos de citotoxicidad in vitro, se cultivaron líneas de macrófagos inmortalizados (células RAW 264.7, BCRJ-0212) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) completo modificado para contener GlutaMAX (Gibco) 4 mM, glucosa 4500 mg/l, 1 mM. piruvato de sodio (Sigma-Aldrich) y 1500 mg/L de bicarbonato de sodio (Sigma-Aldrich) con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Sigma-Aldrich). Se cultivaron células RAW 264.7 y se mantuvieron a 37 °C y 5% de CO2. Después de la formación de la monocapa celular, las células adherentes se separaron mediante raspado. Inicialmente, se sembraron células RAW 264.7 (2 x 105 células/pocillo) en placas de 96 pocillos, se cultivaron durante 24 h para su adhesión y luego se trataron con diferentes diluciones de la formulación de virosoma (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 y 1:256, v/v) durante 24, 48 y 72 h. Este procedimiento se repitió para diferentes pases del cultivo celular hasta alcanzar el tamaño de muestra deseado (n = 8). Las células de control recibieron el mismo volumen de un liposoma simple (preparado con fosfolípidos - Lipoid® S100, Lipoid). La viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, Sigma-Aldrich). Al final de cada tiempo de incubación, se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con DPBS (Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 3 h con una solución de MTT de 5 mg/ml a 37 °C. Después de la incubación, los cristales de formazán precipitados se disolvieron en 200 µl de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich). Las densidades ópticas (OD) se midieron a 540 nm utilizando un fotómetro de microplacas Multiskan™ FC (Thermo Fisher Scientific). Los valores de absorbancia registrados para las células no tratadas (control negativo) representan el 100% de la viabilidad celular y se utilizaron como referencia para calcular el porcentaje de viabilidad celular en presencia de cada concentración de muestra. El análisis de citotoxicidad complementario se realizó utilizando la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y el kit de tinción con yoduro de propidio (PI) (APO-DIRECT™, BD Biosciences). Se sembraron células RAW 264.7 y se trataron con las diluciones de virosoma (1:32 y 1:64) como se describió anteriormente. El ensayo se realizó según las directrices del fabricante a las 24, 48 y 72 h después de la exposición a los virosomas [33]. El protocolo de tinción consistió en incubación celular con enzima TdT-FITC y tinción con yoduro de propidio. Después de 24 y 48 h de exposición, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo (Accuri C6 Plus, Becton-Dickinson, EE. UU.) y se determinó el porcentaje de membranas celulares intactas por grupo. El porcentaje de células vivas se calculó a partir de las lecturas de fluorescencia definidas según las instrucciones del kit.

Los protocolos y el uso de animales para esta investigación cumplieron con el Comité de Ética en el Uso de Animales de Embrapa Porcinos y Avícolas (número de protocolo 001/2016). Se criaron ratones C57BL/6 (hembras, de 6 a 8 semanas de edad) en condiciones SPF y se dividieron en 3 grupos de la siguiente manera: control no vacunado (NV, n = 20), vacunado intranasal (5 µl/fosa nasal o 10 µl/animal , IN, n = 20), vacunados por vía intramuscular (100 µL/animal, IM, n = 20). Un grupo adicional, el control de liposomas no vacunados (n = 20), sirvió como control de los virosomas. El grupo G4 no mostró ninguna diferencia en los análisis realizados en comparación con los animales del grupo NV (datos no mostrados). A la formulación se le añadió un adyuvante mucoadhesivo (carboximetilcelulosa – CMC) (0,125%, m/v) para administración intranasal, y Emulsigen-D® (MVP Adjuvants, EE. UU.) para administración intramuscular (20%, v/v) [34 ]. El protocolo experimental consistió en la administración de dos dosis de la vacuna con 2 semanas de diferencia (días 1 y 15). A los 21 días (día 36) y ocho meses después (día 255) después de la segunda dosis de vacuna, se sacrificaron diez animales/grupo de los tres grupos mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (80 µg/g de peso corporal).

Para la extracción de sangre, los ratones se anestesiaron con ketamina-xilazina intraperitoneal (ketamina 60 µg/g de peso corporal y xilazina 10 µg/g de peso corporal). Se extrajeron muestras de sangre mediante sangrado retroorbitario los días 0 (antes de la vacunación), 3 y 17 (dos días después de cada inmunización). Para evaluar la posible toxicidad de la vacuna se realizó la cuantificación de marcadores bioquímicos de las muestras de suero, evaluando la función hepática (AST y ALT) y renal (urea y creatinina). Estos ensayos se realizaron con kits colorimétricos, según las instrucciones del fabricante (Labtest, Brasil).

Para el análisis histopatológico, se recogieron muestras de tejido de hígado, riñón y pulmón en la necropsia y se fijaron con paraformaldehído tamponado al 4%, se deshidrataron en una serie graduada de etanol, se incluyeron en parafina y se seccionaron a 4 μm. Este material se tiñó con hematoxilina-eosina (H&E). Además, para evaluar la citotoxicidad in vivo del virosoma, se realizó la tinción para detectar apoptosis utilizando el kit de detección de muerte celular in situ (Roche, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Los núcleos se contratiñeron con 3,3-diaminobencidina (Sigma-Aldrich, EE. UU.). El ensayo TUNEL se emplea para identificar y cuantificar núcleos apoptóticos mediante una reacción in situ que implica el marcaje del extremo de mella dUTP-X mediado por TdT. Los núcleos TUNEL positivos se cuantificaron mediante microscopía óptica con un aumento de 400x. El grado de expresión de TUNEL se calculó en 25 campos distintos (correspondientes a un área total de 0,08 mm2). Los resultados se expresaron como células/mm2.

El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de ratones se obtuvo en la necropsia (días 36 y 255), mediante un procedimiento de traqueotomía en una cabina de bioseguridad. BALF se recogió lavando los pulmones cuatro veces con 0,2 ml de solución salina fisiológica estéril (NaCl al 0,9%) a través de la cánula traqueal. Después de la recolección de BALF, se añadió un cóctel inhibidor de proteasa hasta una concentración final de 1x y también fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) hasta una concentración final de 1 mM. Una porción de las muestras BALF se almacenó a -80 °C para el ensayo ELISA. Se realizó ELISA para cuantificar la inmunoglobulina IgA total en el sobrenadante de BALF utilizando el kit Invitrogen (Thermo Fisher, EE. UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Otra parte de las muestras BALF se utilizó para la cuantificación celular. Se aplicó el método de exclusión con azul tripano utilizando una cámara de Neubauer para la cuantificación celular. Para el análisis citológico diferencial, se preparó un frotis de células secas con una alícuota de la suspensión y se tiñó con tinción de May-Grünwald-Giemsa. Los portaobjetos se analizaron mediante microscopía óptica óptica. Se contaron al menos 500 leucocitos por campo de alta potencia y los recuentos diferenciales absolutos de células se calcularon multiplicando el porcentaje de cada tipo de célula determinado por el recuento celular total.

Se anestesiaron los ratones y se recogió sangre, a través del plexo retroorbitario, en los días 0, 36 y 255. Luego, se evaluó la presencia de anticuerpos específicos de IAV en los sueros mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) [35]. Las mismas cepas de IAV utilizadas en la composición de la vacuna virosomal se utilizaron como antígenos en el ensayo HI. Los resultados se informaron como títulos de anticuerpos medios geométricos.

El bazo completo de cada ratón se recogió asépticamente en medio RPMI 1640 (Gibco) en el momento de la necropsia (días 36 y 255). Cada bazo se disoció mecánicamente y se filtró a través de un filtro de nailon (70 µm). Luego, los glóbulos rojos se lisaron con tampón Pharm Lyse™ (BD Biosciences). La reacción de lisis se detuvo añadiendo medio RPMI 1640 con FBS al 2% y las células se lavaron dos veces. Las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo, suplementado con FBS al 10% (Gibco, Brasil), GlutaMAX 1 mM (Gibco, Brasil), HEPES 25 mM (Sigma-Aldrich, EE. UU.), Piruvato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich, EE. UU.), 2-mercaptoetanol 50 M (Gibco, EE. UU.) y penicilina-estreptomicina 100 U/mL (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Finalmente, se contó el número de células con azul tripán al 0,4% para determinar la concentración de células viables. En general, los bazos de los ratones produjeron alrededor de 8 a 10 × 107 esplenocitos viables. Las células se resuspendieron en FBS al 95% + DMSO al 5% (Sigma-Aldrich) y se criopreservaron a una concentración final de 2 x 106 células/ml.

Las células viables del bazo se descongelaron y se suspendieron en DPBS a una concentración de 5 × 106 células/ml y se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) 2,5 µM aplicando el kit de proliferación celular CellTrace™ CFSE (Invitrogen), según informes anteriores [36]. . Después del etiquetado CFSE, los esplenocitos se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo y se sembraron en placas de 24 pocillos (5 x 106 células/pocillo). Posteriormente, las células se estimularon in vitro añadiendo 8000 DICT50/mL de los tres virus vacunales (H1N1, H1N2 y H3N2) durante 96 h a 37 °C, bajo 5% de CO2, en oscuridad. Para el control negativo, solo se añadió medio de cultivo a las células (células no estimuladas por virus) y para el control positivo, las células se estimularon por separado con 5 µg/mL de Concanavalina A de Canavalia ensiformis (Sigma-Aldrich). Después de la estimulación in vitro de células con los virus H1N1, H1N2 y H3N2, se midió la proliferación de linfocitos del bazo como indicador de las respuestas de las células T y B 21 días después de la inmunización de refuerzo.

CFSE en combinación con anticuerpos monoclonales (mAb) permitió el acceso concomitante a la proliferación celular y al estado de activación de subpoblaciones celulares. La proliferación se detectó por la pérdida de fluorescencia del CFSE [36]. Se realizó un análisis de citometría de flujo para identificar y cuantificar subpoblaciones de linfocitos (CD3e, CD4, CD8α, CD19, CD45R/B220 y sIgM mAb), para medir los niveles de activación celular y expresión de marcadores maduros en reposo (CD23, CD25 y CD69 mAb), y Expresión de marcadores de memoria celular (CD62L y CD44 mAb) (Becton Dickinson; Tabla 1). Las densidades celulares se calcularon y transfirieron a tubos de citometría de flujo (aproximadamente 1 × 106/pocillo). Las células se trataron con una solución bloqueadora (10 % v/v de suero de ratón normal) para bloquear los sitios de unión desocupados en el segundo anticuerpo y, por lo tanto, las células se marcaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una habitación oscura con un cóctel de mAb específicos (Tabla 1), 7-aminoactinomicina D (7-AAD) y controles de isotipo (BD Biosciences). Las concentraciones de anticuerpos utilizadas estuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Antes del análisis de la muestra, se verificaron los ajustes del citómetro de flujo utilizando perlas de seguimiento y configuración del citómetro (perlas CS&T, BD), como se describe en las instrucciones del fabricante. Se utilizaron perlas de compensación con tinciones individuales de cada anticuerpo para establecer los ajustes de compensación. La matriz de compensación se aplicó de manera idéntica a todas las muestras. El nivel umbral de dispersión lateral (SSC) se fijó en 8.000 unidades para eliminar los desechos. Las puertas que se consideraron que indicaban células con tinción positiva y negativa se establecieron en función de las pruebas de fluorescencia menos uno (FMO) de las muestras y estas puertas se aplicaron de manera consistente a cada muestra, lo que permitió ajustes menores para la variabilidad del SSC. Se utilizó tinción con 7-aminoactinomicina D (7-AAD) para distinguir las células muertas de las viables mediante citometría de flujo. En el procedimiento preliminar para configurar los parámetros técnicos del instrumento, se utilizaron controles de isotipo para evaluar la tinción inespecífica de fluorocromo. Se preparó tampón para citometría de flujo en PBS que contenía 0,01 % p/v de azida sódica (Sigma-Aldrich), 2 % v/v de FBS (Gibco) y 2 % p/v de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich).

Se adquirieron un total de 100.000 eventos por tubo en el citómetro de flujo (Accuri C6 Plus y FACSCanto, Becton-Dickinson, EE. UU.) y se analizaron utilizando el software FlowJo (Becton-Dickinson, EE. UU.). La puerta de los linfocitos se configuró en propiedades de dispersión de luz (dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral). La proliferación por CFSE (reflejada por la reducción sucesiva de las intensidades de fluorescencia mediante la distribución del tinte a las células hijas) se midió mediante citometría de flujo. Los resultados se expresaron como porcentajes de células teñidas.

Las diferencias entre los grupos vacunados (vía intranasal – IN e intramuscular – IM) y los grupos no vacunados (NV) en datos bioquímicos, inmunoglobulinas, tasa de apoptosis y recuento de células BALF se analizaron mediante ANOVA, utilizando el procedimiento MIXED del Statistical Analysis System (SAS). - Cary, Carolina del Norte, EE.UU.). Además, las diferencias entre estos grupos en el ensayo de proliferación celular in vitro se evaluaron mediante la prueba t de Student bilateral. Se realizó análisis de varianza (prueba F) para evaluar el efecto de la vía de administración y la edad en el ensayo de proliferación celular in vitro, aplicando la prueba de Tukey siempre que se detectara un efecto significativo (P ≤ 0,05) del virosoma. Para el análisis del HI se utilizó el nivel descriptivo de probabilidad de la prueba exacta de Fisher; los porcentajes seguidos de letras distintas en las líneas difieren significativamente según la prueba exacta de Fisher. Los valores de p ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos [37].

Los virus de la influenza propagados se concentraron aproximadamente 500 veces después de la concentración mediante ultracentrifugación y purificación mediante ultrafiltración. La Tabla 2 presenta los títulos de hemaglutinación y el contenido de HA de los IAV antes de la preparación de los virosomas multivalentes. Se llevó a cabo un estudio de preformulación y descubrimos que el uso de volúmenes equivalentes de cada cepa de virus (1:1:1) conducía a una formulación más estable en almacenamiento refrigerado.

Los virosomas purificados se cargaron en un gel de poliacrilamida para electroforesis. El análisis SDS-PAGE (método semicuantitativo que utiliza albúmina como estándar; Fig. 1) mostró que los virosomas purificados contenían principalmente HA, según el peso molecular esperado de cada glicoproteína de IAV. El contenido total de HA de los virosomas fue de casi 160 µg/ml. Además, considerando el contenido de HA para cada virus, estimamos que el HA total presentado en la formulación corresponde a 6, 21 y 73% para H1N1, H1N2 y H3N2, respectivamente, debido a las diferencias en el contenido de HA para cada cepa.

Gel SDS-PAGE y curva estándar de albúmina sérica bovina (aproximadamente 66,5 kDa). Se utiliza para cuantificar la hemaglutinina de las cepas virales y virosomas multivalentes. En el gel SDS-PAGE es visible: HA compuesta de dos formas, HA no escindida (HA0 ≈ 75–65 kDa) y HA escindida (HA1 ≈ 55 kDa y HA2 ≈ 27 kDa); y NA (≈ 45–50 kDa). Las intensidades de las bandas se adquirieron utilizando el software ImageJ.

La formulación del virosoma se caracterizó en términos de tamaño de partícula y potencial zeta, que rondaron los 110 nm (PDI = 0,19) y -6,2, respectivamente. Las imágenes TEM mostraron estructuras circulares y elipsoides como se muestra en la Fig. 2. Los virosomas presentaron un diámetro promedio de 100 nm y una membrana unilaminar, a veces seguida de ampollas cerca de ella.

Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de virosomas multivalentes producidos con cepas de influenza H1N1, H1N2 y H3N2. Imagen capturada a 80 kV

Al principio, para garantizar que el virosoma estuviera formado por una nanopartícula no infecciosa, se evaluó la infectividad del virosoma en huevos de gallina embrionados y en células MDCK. No se observó replicación viral en huevos de gallina embrionados inoculados con virosomas y no hubo efecto citopático visible en la línea celular en comparación con las células de control.

La viabilidad de las células RAW 264.7 se evaluó después de exponer las células durante 24, 48 y 72 h a diferentes diluciones 1:2 a 1:256 (v/v) del virosoma (Tabla 3). Después de 24 y 48 h de incubación, las células presentaron una viabilidad celular superior al 80% para todas las diluciones de virosomas, lo que indica la seguridad de los virosomas. Sin embargo, después de 72 h de exposición de las células a las diluciones de virosoma de 1:2 a 1:8, la viabilidad celular osciló entre 75 y 80%, lo que demuestra que la exposición a largo plazo fue ligeramente citotóxica. Además, en comparación con el control negativo en el ensayo MTT, la exposición a las otras diluciones de virosomas evaluadas no presentó ningún efecto sobre la viabilidad celular (> 80%) en este intervalo de incubación. En general, la formulación de virosoma fue bien tolerada en diluciones de 1:16 a 1:256 en todos los tiempos de exposición. En términos de apoptosis celular, la tasa de citotoxicidad (células apoptóticas) determinada por citometría de flujo osciló entre 1 y 2% para ambas diluciones de virosomas evaluadas (1:32 y 1:64) durante los mismos períodos de tiempo (24, 48 y 72 h). [38].

No se detectaron signos de lesión significativos ni diferencias entre los ratones vacunados y no vacunados, independientemente de la ruta de administración de la vacuna virosomal (Tabla S1, archivo adicional 1). Los valores hepáticos (AST y ALT) y renales (urea y creatinina) estaban dentro del rango normal [39]. Además, los ratones no mostraron reacciones adversas asociadas con la inmunización utilizando los virosomas.

Respecto al análisis histopatológico, los diferentes tejidos evaluados (riñón, pulmón e hígado) no mostraron cambios microscópicos relevantes. Además, el ensayo TUNEL no reveló diferencias en la tasa de apoptosis celular en el riñón y el hígado de los animales inmunizados con el virosoma, que fue similar al grupo de control a los 36 días (Figura S1, archivo adicional 2).

En promedio, el volumen BALF recuperado fue del 82%. Los valores medios para el recuento total de células de BALF a los 36 días de ratones en los grupos vacunados por vía intranasal, vacunados por vía intramuscular y no vacunados fueron 8,8 ± 1,2 × 105 células/mL, 7,65 ± 0,9 × 105 células/mL y 5,7 ± 0,7 × 105 células/mL, respectivamente. En todos los grupos, la composición celular de BALF consistió predominantemente en macrófagos alveolares (> 53%) y una menor cantidad de linfocitos (< 43%) y neutrófilos (< 1%). Ambos grupos de ratones inmunizados (intranasal e intramuscular) mostraron un aumento en la población de linfocitos (P ≤ 0,0001) en comparación con los animales no inmunizados (Tabla 4). Los ratones inmunizados por vía intranasal también tuvieron un mayor aumento en la población celular total.

Los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) para los tres subtipos de IAV (H1N1, H1N2 y H3N2) se midieron en muestras de suero obtenidas los días 21 (día 36) y 240 (día 255) después de la inmunización de refuerzo tanto para la inmunización intramuscular como para la intranasal. Los sueros de ratones inmunizados con virosomas por vía intramuscular mostraron un aumento significativamente mayor en los títulos de HI que la inmunización intranasal para las tres cepas vacunales (P ≤ 0,0001; Fig. 3). En las evaluaciones de seguimiento (días 36), todos los ratones del grupo vacunado por vía intramuscular tenían títulos de anticuerpos HI inducidos por la vacuna (˃1:40) contra H3N2. Se detectaron respuestas débiles a los títulos de anticuerpos contra H1N1 y H1N2 (˂1:40) en unos pocos ratones inmunizados por vía intramuscular. Sin embargo, la vacuna intramuscular fue inmunogénica en ratones y provocó importantes respuestas de anticuerpos HI contra H1N1, H1N2 y H3N2. La seroconversión a la inmunización intramuscular 21 días después de la inmunización de refuerzo fue 90% H1N1, 80% H1N2, 100% H3N2.

Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). (NV) no vacunados, (IM) vacunados por vía intramuscular y (IN) vacunados por vía intranasal. Títulos de anticuerpos mediante prueba HI para los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 en muestras de suero de ratones los días 21 y 240 después de la vacunación. Los datos se muestran para cada ratón por grupo y las líneas negras representan los títulos medios geométricos ± desviación estándar.

Los ratones vacunados por vía intranasal, por otro lado, no desarrollaron títulos de anticuerpos HI detectables 21 días después de la inmunización de refuerzo (día 36). Sólo un ratón vacunado por vía intranasal tenía anticuerpos HI contra los virus H1N1 (título 1:40), H1N2 (1:40) y H3N2 (1:40) 8 meses después de la segunda inmunización, como se muestra en la Fig. 3. La inmunización intramuscular provocó una mayor tasa de seroconversión (90% H1N1, 40% H1N2, 100% H3N2) en comparación con la inmunización intranasal (10% H1N1, 10% H1N2, 10% H3N2) 8 meses después de la inmunización de refuerzo.

La inmunoglobulina IgA total se cuantificó en el BALF de ratones. Los ensayos ELISA para anticuerpos totales revelaron que, independientemente de la vía de administración, los ratones vacunados tenían una concentración de IgA más alta que los ratones no vacunados (6,85 ± 0,98 mg/dL) el día 21 después de la vacunación (P ≤ 0,0001). Los animales vacunados por vía intranasal con el virosoma (57,84 ± 3,61 mg/dL) tuvieron concentraciones de IgA más altas que los ratones vacunados por vía intramuscular (36,81 ± 5,39 mg/dL, P ≤ 0,0001; Fig. 4).

Cuantificación del anticuerpo IgA total en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de ratones mediante ensayo ELISA. Los datos se muestran para cada ratón por grupo y las líneas negras representan la media ± error estándar. NV = no vacunados; IM = vacunado por vía intramuscular; IN = vacunado por vía intranasal

Para examinar si el virosoma induce inmunidad mediada por células, se obtuvieron suspensiones de células T de ratones vacunados los días 21 y 240 después de la segunda vacunación. Las puertas se establecieron utilizando la muestra no estimulada por virus para cada ratón individual. En resumen, la puerta se basó en las características de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para estimar la población de linfocitos y excluir los desechos. Las células doblete se sometieron a un trazado doblete que muestra la altura de dispersión directa (FSC-H) frente al área de dispersión directa (FSC-A). Las células muertas se excluyeron del análisis mediante tinción con 7-AAD. La proliferación de linfocitos se determinó mediante CFSElow, lo que permitió evaluar la proliferación específica inducida en cada grupo experimental por cada virus (H1N1, H1N2 y H3N2). La contratinción con CD3e y CD45R/B220 nos permitió identificar células T y B, respectivamente. Entre los linfocitos T (CD3e+), se distinguieron subconjuntos de células T CD4+, células T CD8α+, CD62L, CD44, CD25 y CD69 mediante paneles. En el primer análisis, se utilizaron puertas en las poblaciones CD4+ y CD8+ para el análisis de subgrupos de linfocitos T. En el segundo análisis, se utilizaron puertas en las poblaciones CD69+ y CD69+CD25+, y en el tercer análisis, se utilizaron puertas en las poblaciones CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh y CD3e+CD4+CD44highCD62Llow. Entre las células de linfocitos B, los linfoblastos activados se tiñeron con un cóctel de anticuerpos de activación de linfocitos B de ratón y un cóctel de anticuerpos del subconjunto de linfocitos B de ratón.

El ensayo de proliferación de linfocitos estimulados in vitro identificó diez subconjuntos de células distintas: CD3e+CD4+ (linfocitos T CD4+), CD3e+CD8α+ (linfocitos T CD8+), CD3e+CD69+ (células T de activación muy temprana), CD3e+CD69+CD25+ ( células T efectoras), CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh (linfocitos T CD4+ de memoria central), CD3e+CD4+CD44highCD62Llow (linfocitos T CD4+ de memoria efectora), CD19+CD69+ (células B de activación muy temprana), CD19+CD69+CD25+ (células efectoras células B), CD45R/B220+sIgM+ (células B inmaduras y maduras o células B de transición) y CD45R/B220+sIgM+CD23+ (células B maduras convencionales en reposo).

En particular, las inmunizaciones intramusculares e intranasales indujeron una sólida respuesta de células T y B (Fig. 5). Para los virus H1N1, H1N2 y H3N2, los ratones vacunados con virosomas (inmunización intramuscular e intranasal) tenían niveles más de 2 veces mayores de subconjuntos de células T que los ratones no vacunados o sin tratamiento previo (Fig. 5). Tanto la inmunización intramuscular como la intranasal dieron como resultado subconjuntos de células T más altos CD3e+CD4+, CD3e+CD8α+, CD3e+CD69+, CD3e+CD69+CD25+, CD3e+CD4+CD44highCD62Lhigh y CD3e+CD4+CD44highCD62Llow para H1N1 (P ≤ 0,0001). H1N2 (P ≤ 0,001) y H3N2 (P ≤ 0,001) (Fig. 5 y Tabla S2, archivo adicional 1). La ruta de administración influyó en la cantidad de algunos subconjuntos de células, con la inmunización intranasal produciendo más células CD3e+CD69+ (P ≤ 0,05) y la administración intramuscular produciendo más células CD3e+CD69+CD25+ (P ≤ 0,05; Tabla 5).

Ensayo de proliferación celular in vitro. Las células inmunes en el ensayo de proliferación de esplenocitos estimuladas con los virus de la vacuna (H1N1, H1N2 y H3N2) se compararon como un cambio en veces del grupo vacunado por vía intranasal (IN) e intramuscular (IM) con respecto al grupo no vacunado (NV) el día 21. posvacunación. Los datos mostrados son el aumento en veces del porcentaje medio y el error estándar de las células inmunitarias indicadas de ratones vacunados frente a las de ratones no vacunados (NV). ¥P ≤ 0,05 frente a NV, £P ≤ 0,005 frente a NV, #P ≤ 0,001 frente a NV, φP ≤ 0,0005 frente a NV y *P ≤ 0,0001 frente a NV.

Los ratones inmunizados (intramuscular e intranasal) con virosomas mostraron un aumento significativo a los 21 días post-vacunación (día 36) en los números absolutos de células efectoras (CD19+CD69+ y CD19+CD69+CD25+), transicionales y maduras (CD45R/ B220+sIgM+) en comparación con el valor inicial (P ≤ 0,05) para H1N1, H1N2 y H3N2 (Fig. 5; Tabla 5). En contraste, la inmunización intranasal favoreció un mayor establecimiento de subconjuntos de células B, CD45R/B220+sIgM+, CD19+CD69+ y CD19+CD69+CD25+, para H1N1, H1N2 y H3N2 que la inmunización intramuscular (Tabla 5).

Inducir una inmunidad protectora duradera es uno de los objetivos de la vacunación. Por lo tanto, evaluamos la longevidad de las respuestas de anticuerpos contra H1N1, H1N2 y H3N2 inducidas por la vacunación con virosomas. Las respuestas de anticuerpos HI específicos contra H1N1, H1N2 y H3N2 en ratones inmunizados con virosomas se mantuvieron en niveles significativamente más altos (Fig. 5) que los de ratones no vacunados durante más de 8 meses, lo que indica que la inmunidad al virus de la influenza puede ser duradera.

Para evaluar la eficacia protectora a largo plazo, también se analizaron las respuestas inmunes celulares en grupos de ratones que fueron inmunizados por vía intramuscular e intranasal con virosomas multivalentes 8 meses después de la vacunación.

Como se muestra en la Tabla 5 (comparación entre vías de administración) y la Tabla S2, archivo adicional 1 (comparación entre el grupo no vacunado versus el grupo vacunado por vía intramuscular y el grupo no vacunado versus el grupo vacunado por vía intranasal), 8 meses después de la inmunización de refuerzo, los ratones inmunizados mostraron una ruta Aumento -dependiente de CD45R/B220+sIgM+CD23+ en comparación con el grupo no vacunado (P ≤ 0,0001). En comparación con los ratones no vacunados, los ratones inmunizados por vía intramuscular e intranasal exhibieron una proliferación significativa de células T y B en respuesta a H1N1, H1N2 y H3N2 (P ≤ 0,05; Tabla S2, archivo adicional 1). Sin embargo, los ratones inmunizados por vía intranasal mostraron un mayor nivel de proliferación del subconjunto de células T (CD3e+CD69+; Tabla 5) que los ratones inmunizados por vía intramuscular. Los subconjuntos de células CD3e+CD4+CD44high CD62Lhigh y CD3e+CD4+CD44high CD62Llow para H1N1, H1N2 y H3N2 fueron significativamente mayores cuando se inmunizaron por vía intramuscular que intranasal (P ≤ 0,05), así como los subconjuntos de células CD3e+CD69+CD25+ y para H1N1. (Tabla 5). Las inmunizaciones intramusculares indujeron mayores respuestas centrales relacionadas con la memoria en tejidos distintos de la mucosa respiratoria, como el bazo.

El diseño de nuevas vacunas candidatas que imiten fielmente la morfología nativa del virus específico sin ser patógenas en sí mismas sigue siendo un desafío importante en el desarrollo de vacunas contra la influenza [40]. Los virosomas son partículas similares a virus estrictamente controladas que pueden usarse en la formulación de vacunas [41]. En general, la vacunación o la infección no confieren una protección duradera debido a la aparición de cepas del virus de la influenza A nuevas o antigénicamente distintas [4]. Por tanto, el desarrollo de vacunas nuevas, altamente eficaces y bien toleradas es fundamental. En un estudio de inmunogenicidad y seguridad en humanos, se comparó un prototipo de vacuna contra la influenza con virosoma trivalente con vacunas comerciales de subunidades y virus inactivados completos [42]. La vacuna virosoma produjo títulos protectores más altos y fue menos reactógena y más inmunogénica que las vacunas contra la influenza con virus completamente inactivado o con subunidades. La síntesis de liposomas utilizando envolturas del virus de la influenza A (virosoma), que contienen los principales antígenos virales (HA y NA), ha arrojado resultados alentadores [4, 27]. En la presente investigación, diseñamos un virosoma multivalente a partir de un cóctel de glicoproteínas de superficie de los virus H1N1, H1N2 y H3N2 utilizando la técnica de reconstitución con DCPC como detergente, y se investigó su inmunogenicidad como candidata a vacuna swIAV en ratones. de Jonge, Holtrop [43] demostró que el uso de DCPC como solubilizante de membrana viral tiene ventajas significativas sobre el enfoque convencional de síntesis de virosomas, que implica la solubilización de la envoltura viral con Triton X-100, seguida de su eliminación con perlas de poliestireno. . Considerando la alta concentración micelar crítica de DCPC, la diálisis es un procedimiento eficiente para la eliminación de DCPC, permitiendo el autoensamblaje de vesículas virosomas con el beneficio de no alterar los antígenos virales (HA y NA), un problema común relacionado con Triton X. -100 (alteración de la conformación de la proteína y pérdida de antigenicidad) [44, 45].

El análisis SDS-PAGE reveló que los virosomas multivalentes contenían bandas de proteínas HA y NA y carecían de complejos de nucleocápsida del virus. El diámetro medio de los virosomas fue de unos 110 nm, lo que concuerda con las observaciones realizadas en experimentos anteriores [46]. En cuanto a la confirmación de HA (y en menor medida NA) por electroforesis, esto puede resultar en la presentación de antígenos adicionales por proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad clases I y II (MHC-I y MHC-II), lo que resulta en la activación de T - y células B y células dendríticas, como se observa durante la infección viral [47, 48]. Además, los virosomas de la influenza son una estrategia muy prometedora para ahorrar dosis de antígeno, porque conduce a una alta respuesta inmunogénica en dosis bajas sin afectar el efecto protector de la vacuna [49]. Demostramos que los virosomas swIAV son altamente inmunogénicos y pueden provocar una fuerte respuesta inmune humoral y celular contra los virus H1N1, H1N2 y H3N2.

Evaluar la seguridad in vitro del virosoma es fundamental para considerarlo como nuevo prototipo de vacuna antes de su administración a animales [48]. Para esto, para asegurar que el virosoma no tenga infectividad, la nanoformulación se inoculó en huevos de gallina embrionados, revelando la ausencia de virus viable, pero con la presencia de actividad de aglutinación de HA, lo que sugiere que la alteración del virus y la reconstitución del virosoma han tenido éxito. Además, se realizaron ensayos de viabilidad celular, revelando que no se detectaron alteraciones significativas en ninguna de las diluciones de virosomas evaluadas. Este resultado sirvió como confirmación de su seguridad para experimentos in vivo.

El examen citológico de BALF reveló que la infiltración de células linfocitarias en las vías respiratorias era significativamente mayor en los ratones vacunados que en los no vacunados. En estudios anteriores, esta infiltración de linfocitos en BALF sugirió que la respuesta inmune celular causada por la vacunación podría estar relacionada con las respuestas celulares inflamatorias observadas en los pulmones [50]. Sin embargo, la infiltración de linfocitos en los bronquios y alvéolos y la hiperplasia linfoide alrededor de los bronquios y los vasos sanguíneos no se observaron ni en los grupos vacunados ni en los no vacunados. Además, no se observaron cambios en la tasa de apoptosis celular en los pulmones de ratones vacunados.

La literatura carece de definiciones operativas establecidas para la disminución de la inmunidad contra la influenza; por lo tanto, la inmunogenicidad en este estudio se evaluó utilizando los criterios de la Agencia Europea para la Evaluación de Medicamentos (EMEA) [51]. Los anticuerpos dirigidos contra la proteína HA medidos mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) se correlacionan con la protección contra la influenza [3]. En el modelo de ratón, incluso niveles bajos de inmunidad preexistente a la influenza (memoria inmunológica) tienen un efecto inmunoestimulante, ya que mejoran la respuesta de anticuerpos contra antígenos no relacionados administrados por los virosomas de la influenza [48]. Por lo tanto, para confirmar la inmunogenicidad protectora, se debe lograr al menos uno de los tres requisitos de la EMEA: (i) seroconversión definida por un aumento de ˃4 veces en el título de anticuerpos HI, alcanzando un título de HI de ≥ 1:40, en ˃40% de sujetos inmunizados; (ii) un aumento en los títulos medios geométricos (GMT) de 2,5 veces; y (iii) seroprotección definida por el logro de un título de HI de ≥ 1:40 en ˃70% de los sujetos. Se administraron liposomas que no contenían proteínas del virus de la influenza a un grupo de control adicional (datos no mostrados). Este grupo mostró resultados de anticuerpos HI similares a los del grupo no vacunado. Un hallazgo importante fue que el virosoma polivalente basado en la influenza generó títulos de HI protectores contra las tres cepas de IAV que fueron significativamente más altos en los ratones inmunizados por vía intramuscular en comparación con los ratones inmunizados por vía intranasal. Según los criterios de la EMEA, se logró seroconversión y seroprotección para tres cepas de IAV mediante virosoma administrado por vía intramuscular. En cuanto al hecho de que los ratones utilizados estaban libres de patógenos específicos y eran isogénicos, incluso sin la evaluación de anticuerpos antes de la inmunización, el cambio se comparó con los títulos de anticuerpos de ratones no vacunados, que se consideraron niveles iniciales. Por otro lado, los ratones inmunizados por vía intranasal tenían títulos de anticuerpos no protectores al inicio del estudio, que eran similares a los de estudios anteriores [52]. Sólo uno de los animales vacunados por vía intranasal mostró anticuerpos HI ocho meses después de la vacunación. Según este animal, para obtener una respuesta vacunal mucosa de calidad contra el VIA, será necesario reevaluar la formulación y considerar nuevas estrategias para provocar respuestas inmunes sistémicas y mucosas, incluido el uso de adyuvantes vacunales apropiados. Es casi seguro que los niveles de anticuerpos aumentaron más gradualmente, el pico posvacunación fue posterior y no se detectó en el análisis inicial. Sin embargo, nuestros hallazgos indican que la inmunización con virosomas swIAV multivalentes administrados por vía nasal es capaz de generar respuestas inmunes locales, estimulando una mayor producción de IgA en BALF, lo que puede contribuir a la protección de los ratones contra un desafío posterior. Por lo tanto, la inmunización intranasal con swIAV basado en virosomas no indujo una respuesta inmune humoral sistémica, pero pudo inducir una respuesta inmune humoral local. Además, destacamos que la formulación intranasal consistió en un sistema mucoadhesivo simple (inclusión de carboximetilcelulosa), y posiblemente los resultados inmunológicos podrían mejorarse con el diseño de un sistema de administración intranasal más sofisticado.

La proliferación de linfocitos del bazo es significativamente mayor en el grupo vacunado que en el grupo no vacunado. Nuestros hallazgos mostraron que la vacuna virosomal swIAV multivalente fue capaz de inducir células B efectoras, de transición y maduras, así como células T efectoras y de memoria, con una mayor proliferación después de la estimulación del virus. Las nanopartículas y posiblemente los virosomas a menudo encapsulan moléculas de ligando para receptores de reconocimiento de patrones (PRR; por ejemplo, receptores tipo Toll, TLR) que se expresan en células dendríticas y células B [53, 54]. Los virosomas expresados ​​a veces contienen ADN o ARN viral, que tiene el potencial de activar sensores de ADN o ARN (es decir, TLR9 y TRL7) en células B y células dendríticas [55]. Por lo tanto, especulamos que las señales de TLR podrían desempeñar funciones potenciadoras de anticuerpos durante la inmunización de refuerzo de las células B de memoria en nuestro sistema experimental. Además, las nanovacunas pueden actuar directamente sobre las células B de memoria de unión a P; eventualmente reciben señales robustas del receptor de células B (BCR) o una mayor ayuda de las células T como resultado de un fuerte entrecruzamiento de BCR [54]. La estimulación de los esplenocitos de ratones vacunados con los virus H1N1, H1N2 y H3N2 también provocó una mayor proliferación celular de células B efectoras, transicionales y maduras en estas condiciones.

Se sabe que las respuestas de las células T ayudan en la expansión de la inmunidad de protección cruzada [56]. La respuesta de proliferación celular del grupo de control de liposomas (datos no mostrados) fue la misma que la del grupo no vacunado. Nuestros hallazgos mostraron una mayor cantidad de células T auxiliares CD3e+CD4+, T CD3e+CD8a+ citotóxicas y CD3e+CD69+CD25+ T efectoras en ratones vacunados. Los virosomas multivalentes de swIAV provocaron una sólida respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediada por linfocitos T CD8+, que es importante para la eliminación del virus [57]. La inducción de una respuesta T colaboradora es necesaria para que se respalde la respuesta de células B específicas de antígeno y/o linfocitos T citotóxicos [48]. Es de destacar que la inmunización intranasal e intramuscular se asoció con una mayor adquisición de CD69, marcador de residencia asociado con la retención en tejidos linfoides [58].

La evidencia observada en este estudio sugiere que la inmunización con el virosoma indujo células T CD4+ de memoria central y de memoria efectora. Estos subconjuntos de memoria, tanto a corto como a largo plazo, surgen después de la estimulación antigénica con mayores capacidades proliferativas y reconstitutivas en ratones inmunizados. Las células T de memoria inducidas por la vacuna pueden ser decisivas para generar inmunidad duradera e inducir la destrucción viral. Observamos que las células T CD4+ efectoras y de memoria central eran abundantes 21 días después de la inmunización de refuerzo, pero disminuyeron con el tiempo, aunque seguían siendo más altas en comparación con los ratones no vacunados. Por lo tanto, las células T CD4+ de memoria central inducidas por la inmunización con virosomas tienen una duración prolongada y pueden proporcionar ayuda sostenida a las células T CD8+ [59]. La población de células T de memoria de larga duración tiene una mayor capacidad de autorrenovación y multipotencia para generar toda la memoria (memoria central y memoria efectora) y subconjuntos de células T efectoras in vitro [60]. Los ratones fueron vacunados dos veces, lo que fue suficiente para provocar una respuesta de células T de memoria específica de IAV H1N1, H1N2 y H3N2, eliminando la necesidad de enfoques heterólogos de cebado-esfuerzo. Por lo tanto, evitar la estimulación antigénica continua que puede conducir a una pérdida progresiva del potencial de memoria, como consecuencia indeseable, impulsará a las células T hacia la diferenciación terminal, lo que compromete su capacidad para eliminar infecciones sistémicas [61, 62]. La presencia significativa de células de memoria después de la vacunación y su capacidad proliferativa mejorada pueden sostener la generación de todos los subconjuntos de células T efectoras y de memoria.

En conjunto, estos hallazgos tienen implicaciones importantes para el diseño de vacunas basadas en células T que se dirigen a patógenos intracelulares, como el virus de la influenza [60]. Además, sospechamos que las medidas de inmunidad observadas aquí son inferiores a la inmunidad descrita demostrada por la provocación viral. La HI está bien aceptada como parámetro para definir la protección inducida por la vacunación. Además, HI cuantifica la respuesta de los anticuerpos a la cabeza globular de la hemaglutinina de la influenza, pero no evalúa la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la infección por el virus [63, 64]. No obstante, existe una fuerte correlación entre la HI y los anticuerpos neutralizantes virales funcionales [63]. Finalmente, incluso si se logra seroprotección en > 70% de los ratones isogénicos vacunados por vía intramuscular contra los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2, futuros estudios de seroprotección en las especies objetivo (cerdos) son cruciales. Los títulos de anticuerpos pueden fluctuar antes y después de la vacunación debido a una variedad de circunstancias, incluidas infecciones e inmunizaciones antigripales previas, variaciones genéticas e infecciones heterólogas previas [63], pero nuestros ratones no tenían títulos de anticuerpos antes de la primera inmunización. Según los resultados obtenidos, el virosoma multivalente swIAV diseñado fue inmunogénico en ratones cuando se administró por vía intramuscular, induciendo anticuerpos sistémicos y potencial de protección contra la infección por influenza.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos originales se proporcionan con este documento.

7-aminoactinomicina D

Líquido de lavado broncoalveolar

receptor de células B

Albúmina de suero bovino

Éster succinimidílico de carboxifluoresceína

Carboximetilcelulosa

Configuración y seguimiento del citómetro

Linfocito T citotóxico

1,2-dicaproil-sn-glicero-3-fosfocolina

Medio de águila modificado por Dulbecco

Dimetilsulfóxido

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco

Agencia Europea de Evaluación de Medicamentos

Suero bovino fetal

Fluorescencia menos uno

Dispersión frontal

Área de dispersión hacia adelante

Altura de dispersión hacia adelante

Títulos medios geométricos

hemaglutinina

Hematoxilina y eosina

Inhibición de la hemaglutinación

Pandemia H1N1

Virus de la gripe A

intramuscular

intranasal

Anticuerpos monoclonicos

Riñón canino Madin-Darby

Complejo mayor de histocompatibilidad

Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

Neuraminidasa

No vacunados

Densidades ópticas

polietersulfona

Yoduro de propidio

Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

Receptor de reconocimiento de patrones

Sistema de análisis estadístico

Libre de patógenos específicos

dispersión lateral

Virus de la influenza porcina A

Desoxinucleotidil transferasa terminal

Microscopio de transmisión por electrones

Receptor tipo peaje

Tris-NaCl-EDTA

Partícula similar a un virus

Virus completo inactivado

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Los autores agradecen a Arlei Coldebella por el análisis estadístico. VH cuenta con una subvención de la Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES), clave financiera 001.

Este trabajo fue apoyado por la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa, 12.13.10.004.00.00) y la Fundación de Apoyo a la Investigación y la Innovación del Estado de Santa Catarina (FAPESC, proyecto número de acceso 2017TR1738). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Embrapa Porcinos y Avícolas, Concórdia, SC, Brasil

Francisco Noé Fonseca, Danielle Gava, Rejane Schaefer y Ana Paula Bastos

Universidad Federal de Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil

Vanessa Hague y Lana Flavia Barón

Instituto Federal Catarinense – Campus Concórdia, Concórdia, SC, Brasil

Franciana Volpato Bellaver & Gabrielly Bombassaro

Embrapa Recursos Genéticos, Brasilia, DF, Brasil

Luciano Paulino da Silva

Universidad de Brasilia, Brasilia, DF, Brasil

Mayara Simonelly

Embrapa Ganado Lechero, Juiz de Fora-MG, Juiz de Fora, MG, Brasil

Wanessa Araújo Carvalho

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Concebir y diseñar el estudio, FNF y APB; realizaron el experimento, FNF, VH, FVB, GB, DG, LSP, LFB, MS y APB; análisis y curación de datos, FNF, VH, FVB, DG, WCA, RS y APB; redacción – preparación del borrador original, FNF y APB; redacción – revisión y edición, FNF, VH, DG, WCA, RS y APB; adquisición de financiación, APB; supervisión de la investigación, RS y APB. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ana Paula Bastos.

Los autores declaran que no conocen intereses en conflicto ni relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo presentado en este artículo.

Todos los procedimientos experimentales y de manejo animal fueron aprobados por el Comité de Ética en el Uso Animal de Embrapa Porcinos y Avícolas (número de protocolo 001/2016).

No aplica.

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Reimpresiones y permisos

Fonseca, FN, Haach, V., Bellaver, FV et al. Perfil inmunológico de ratones inmunizados con una vacuna polivalente contra la influenza basada en virosomas. VirolJ 20, 187 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02158-0

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Recibido: 24 de mayo de 2023

Aceptado: 11 de agosto de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02158-0

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