Una enzima de modificación de ARN detecta directamente especies reactivas de oxígeno para la regulación traslacional en Enterococcus faecalis

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4093 (2023) Citar este artículo

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Las bacterias poseen sistemas elaborados para gestionar las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS) que surgen de la exposición al sistema inmunológico de los mamíferos y al estrés ambiental. Aquí informamos el descubrimiento de una enzima modificadora de ARN sensible a ROS que regula la traducción de proteínas de respuesta al estrés en el patógeno oportunista y comensal intestinal Enterococcus faecalis. Analizamos el epitranscriptoma de ARNt de E. faecalis en respuesta a especies reactivas de oxígeno (ROS) o dosis subletales de antibióticos inductores de ROS e identificamos grandes disminuciones en N2-metiladenosina (m2A) tanto en el ARN ribosómico 23 S como en el ARN de transferencia. Determinamos que esto se debe a la inactivación mediada por ROS de la metiltransferasa que contiene el grupo Fe-S, RlmN. La eliminación genética de RlmN da lugar a un proteoma que imita la respuesta al estrés oxidativo, con un aumento de los niveles de superóxido dismutasa y una disminución de las proteínas de virulencia. Si bien se estableció que las modificaciones de ARNt son dinámicas para ajustar la traducción, aquí informamos el descubrimiento de una modificación de ARNr dinámicamente regulada y ambientalmente sensible. Estos estudios conducen a un modelo en el que RlmN sirve como un interruptor molecular sensible a redox, transmitiendo directamente el estrés oxidativo para modular la traducción a través del epitranscriptoma de ARNr y ARNt, agregando un paradigma diferente en el que las modificaciones del ARN pueden regular directamente el proteoma.

Las especies reactivas de oxígeno (ROS), como el superóxido (O2−) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), desempeñan papeles fundamentales en la configuración de la evolución bacteriana1. Las bacterias están expuestas a ROS desde una variedad de fuentes, de manera endógena como subproductos de la respiración aeróbica y de manera exógena a partir de productos naturales con actividad redox y las ráfagas respiratorias/oxidativas de las células inmunes de los mamíferos activadas2. Si no se neutralizan, las ROS dañan componentes celulares esenciales, incluidos el ADN, los lípidos, los carbohidratos y las proteínas1. Por lo tanto, las bacterias han desarrollado sistemas de defensa contra ROS, como superóxido dismutasas (SOD), catalasas, glutatión, sistemas de tiorredoxina, peroxidasas y nitrato/nitrito reductasas3. Estas defensas a menudo están reguladas transcripcionalmente por factores de transcripción que detectan ROS, como OxyR, PerR, OhrR y SoxR4,5,6.

La evidencia reciente apunta a mecanismos de regulación traslacional de los sistemas de respuesta al estrés bacteriano. Por ejemplo, la respuesta al estrés hipóxico en las micobacterias implica la reprogramación de docenas de ribonucleósidos modificados en los ARNt (el epitranscriptoma de ARNt) para provocar la traducción selectiva de ARNm sesgados por codones a partir de genes de respuesta a la hipoxia, incluido el factor de transcripción DosR y su regulón. Las modificaciones en otras formas de ARN también participan en diversos procesos celulares al alterar la estabilidad, la estructura, la localización y las interacciones proteína-ARN del ARN8.

Aquí informamos el descubrimiento de una enzima modificadora de ARN sensible a ROS que regula la traducción de proteínas de respuesta al estrés en el patógeno oportunista y comensal intestinal Enterococcus faecalis. Después de la exposición al generador de superóxido, menadiona o dosis subletales de eritromicina y cloranfenicol que inducen ROS, el análisis de 24 ribonucleósidos modificados del epitranscriptoma reveló grandes disminuciones en N2-metiladenosina (m2A) tanto en el ARN ribosómico 23 S como en el ARN de transferencia, posiblemente causadas por Inactivación mediada por ROS de la metiltransferasa que contiene el grupo Fe-S, RlmN. La pérdida de RlmN alteró la expresión de proteínas de una manera que imitaba la exposición a menadiona, como un aumento de la superóxido dismutasa y una disminución de las proteínas de virulencia. Estos estudios sugieren que RlmN actúa como un interruptor molecular sensible a redox que vincula la exposición a ROS ambiental e inducida por antibióticos con la dinámica del epitranscriptoma en el ARN ribosómico y de transferencia para efectuar la traducción de las proteínas de respuesta al estrés.

Si bien la regulación transcripcional en respuesta al estrés está bien establecida en las bacterias, la regulación traduccional se comprende menos. Nuestra demostración de la reprogramación del epitranscriptoma inducida por hipoxia y la traducción sesgada por codones en micobacterias nos llevó a plantear la hipótesis de que un mecanismo similar podría ser válido para la respuesta de Enterococcus faecalis al estrés de la exposición a antibióticos. Aquí cuantificamos 24 modificaciones en el ARNr y el ARNt en dos cepas de E. faecalis: OG1RF, una cepa derivada del aislado oral comensal humano OG19, y V58310, un aislado clínico resistente a múltiples fármacos. V583 posee una metiltransferasa resistente a la eritromicina (ErmB) que metila la posición N6 de la adenosina (m6A, m6,6A) en el ARNr 23 S en la posición 2058 (numeración de Escherichia coli)11 y previene la unión de macrólidos (p. ej., eritromicina), lincosamidas, y estreptogramina B (MLS)11, pero sólo confiere resistencia parcial a la eritromicina12. OG1RF carece de ErmB y, por tanto, es aproximadamente 100 veces más sensible a la eritromicina que V583.

Primero exploramos los efectos de los antibióticos en el epitranscriptoma de V583 mediante el crecimiento de células en presencia de concentraciones subinhibitorias de eritromicina (10 a 200 μg / ml; Fig. 1a). Después de la purificación de 23 S y 16 S rRNA y tRNA y la hidrólisis a ribonucleósidos, se cuantificaron 24 ribonucleósidos modificados mediante espectrometría de masas acoplada a cromatografía (LC-MS) en cada tipo de ARN (Fig. 1b-d, Tabla complementaria 1) . Ni m6A ni m6,6A aumentaron en 23 S rRNA con tratamiento con eritromicina, lo que confirma que la expresión de Erm en V583 es constitutiva12. Si bien la mayoría de las modificaciones monitoreadas permanecieron relativamente sin cambios con el tratamiento, se observó una reducción sorprendente en 2-metiladenosina (m2A) tanto en 23 S rRNA como en tRNA para la exposición a eritromicina (Fig. 1b-d), con dependencia de la dosis (Fig. 1e). ,f).

un flujo de trabajo de elaboración de perfiles de epitranscriptoma. Los cultivos en fase logarítmica de V583 se diluyeron con medio de crecimiento que contenía eritromicina por debajo de su CIM (10–200 µg/ml) y se dejaron crecer durante 5 a 6 duplicaciones hasta la fase logarítmica media, después de lo cual se aisló el ARN y se cuantificaron las modificaciones del ARN mediante LC. -MS/MS. b – d Cambios en los niveles de modificaciones de ARN en V583 con dosis variables de eritromicina (clave en la parte inferior de d) en comparación con células no tratadas. Los niveles de modificación se muestran como cambios en relación con el control no tratado para 23 S rRNA (b), 16 S rRNA (c) y tRNA (d). Las modificaciones se organizan de izquierda a derecha en un tiempo de retención ascendente. Consulte la Tabla complementaria 1 para conocer los nombres, los tiempos de retención y las masas de precursores y iones de producto para las modificaciones del ARN. Las barras de error representan la media ± DE para los valores de cambio calculados a partir de 3 mediciones independientes de la intensidad de la señal normalizada de modificación del ARN en la cepa mutante dividida por la intensidad de la señal promedio para tres muestras de tipo salvaje. e, f Efecto de la dosis de eritromicina sobre la proporción de m2A a adenosina. Los ribonucleósidos se cuantificaron utilizando curvas de calibración LC-MS, como se ilustra para el ARNt en el recuadro. Todos los datos se derivan de 3 experimentos (media ± DE, n = 3). Análisis estadístico mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de Dunnett versus controles no tratados; *P < 0,05; **P<0,005. e Valores p exactos: 30 μg/ml, 0,0291; 100 µg/ml, 0,0220; 200 µg/ml 0,0235. f Valores p exactos: 10 μg/ml, 0,0146; 30 µg/ml, 0,0062; 100 µg/ml, 0,0047; 200 µg/ml, 0,0055.

Para evaluar si la reducción de m2A fue exclusiva de V583, repetimos el estudio con E. faecalis OG1RF en concentraciones de eritromicina permisivas para el crecimiento (0,1–0,3 μg/ml; Tabla complementaria 2). Nuevamente observamos una disminución significativa dependiente de la concentración en m2A tanto en 23 S rRNA como en tRNA (Fig. 2a, b), con cambios insignificantes en las otras 23 modificaciones (Fig. 3 complementaria). Luego preguntamos si la reducción de m2A era exclusiva de la eritromicina o una respuesta general a todos los antibióticos. En 10-25% de las CMI de los diferentes antibióticos (Tabla complementaria 2), m2A se redujo con los macrólidos eritromicina y espiramicina y el antibiótico fenicol cloranfenicol, todos los cuales son bacteriostáticos, pero no con los bactericidas ciprofloxacina, ampicilina o aminoglucósidos kanamicina. y gentamicina (Fig. 2a-c). Los macrólidos y el cloranfenicol se unen a la subunidad ribosomal grande (50 S) en el túnel de salida del péptido y al centro de peptidil transferasa, respectivamente, mientras que los aminoglucósidos se dirigen a la subunidad ribosómica pequeña (30 S), a diferencia de la ciprofloxacina y la ampicilina como inhibidores de la girasa y disruptores de la pared celular. , respectivamente13. La reducción de m2A inducida por antibióticos es menor en OG1RF en comparación con V583 (Fig. 2c), probablemente debido a las concentraciones notablemente más bajas de eritromicina y cloranfenicol utilizadas con OG1RF. Hasta ahora, los datos revelan que la exposición de E. faecalis a concentraciones subinhibitorias de antibióticos que se dirigen a la subunidad ribosomal 50 S reduce selectivamente m2A en 23 S rRNA y tRNA, lo que plantea la cuestión de la base mecanicista de este comportamiento del epitranscriptoma.

OG1RF (a, b) y V583 (c) se expusieron a antibióticos en concentraciones inferiores a sus concentraciones inhibidoras mínimas (CMI), y la cantidad de m2A en ARNt y ARNr 23 S se midió mediante LC-MS. Los niveles de m2A disminuyeron para los macrólidos bacteriostáticos eritromicina (ERY; a – c) y espiramicina (SPI; b), así como para cloranfenicol (CAM; a – c), pero no para el bactericida ciprofloxacino (CIP; c), ampicilina (AMP; c ), o los aminoglucósidos gentamicina (GEN; c) y kanamicina (KAN; a, b). Los datos representan la media ± DE, para n = 4 (c) y n = 3 (a, b) experimentos independientes. Análisis estadístico mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de Dunnett versus controles no tratados. NS no significativo; *P < 0,05; **P < 0,005; ***P < 0,0005. a Valores p exactos: 0,1 ERY, 0,0036; 0,2 ERY, 0,0020; 0,3 ERY, 0,0022; 0,5 SPI, 0,0003; 1 SPI, 0,0003; 0,8 CAM, 0,0006; 1,6 leva, 0,0003. b Valores p exactos: 0,1 ERY, 0,0005; 0,2 ERY; 0,0006; 0,3 ERY, 0,0007; 0,5 SPI, 0,0064; 1,0 SPI, 0,0008; 0,8 CAM, 0,0071; 1,6 CAM, 0,0022. c Valores p exactos: 10 ERY, 0,0149; 30 ER, 0,0039; 100 ERI, 0,0031; 1,6 CAM, 0,0063; 3,2 CAM, 0,0009.

En Escherichia coli, la formación de m2A es catalizada por la ARN metiltransferasa RlmN, que metila A2503 en el ARNr 23 S en el centro de peptidil transferasa en la subunidad ribosómica 50 S y A37 en el subconjunto de ARNt que contienen adenina en esta posición en el bucle del tallo del anticodón. Dado que RlmN en E. faecalis no se ha caracterizado previamente, analizamos los niveles de m2A en un mutante de eliminación de ΔrlmN en OG1RF y encontramos una pérdida completa de la modificación en 23 S rRNA y tRNA (Fig. 3a). Primero preguntamos si la reducción de m2A por macrólidos y cloranfenicol implicaba una regulación transcripcional o traduccional de RlmN. Ni el nivel de ARNm de rlmN (qPCR) ni el nivel de proteína RlmN (proteómica dirigida) se vieron afectados significativamente por el tratamiento con eritromicina (Fig. 3b, c). Estos datos sugirieron que la actividad de RlmN estaba regulada postraduccionalmente por la exposición a antibióticos.

a La pérdida de rlmN elimina m2A en OG1RF (media ± DE, n = 2). b RT-qPCR de rlmN en OG1RF y V583 tras el tratamiento con eritromicina. Los datos representan la media ± DE para 4 experimentos: dos réplicas biológicas analizadas con dos conjuntos de cebadores diferentes. Análisis estadístico mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con prueba de Dunnett versus no tratados: NS no significativo. c Proteómica dirigida de RlmN en OG1RF y V583 tras el tratamiento con eritromicina. Los datos representan la media ± DE para seis experimentos: tres péptidos monitoreados en dos experimentos independientes. Análisis estadístico mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con prueba de Dunnett versus no tratados: NS no significativo. Relación de m2A a A en d 23 S rRNA y e tRNA con tratamiento con menadiona. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Análisis estadístico mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de Dunnett versus no tratados: **P < 0,005; ****, P < 0,0001. d Valores p exactos: 50 μM, 0,0886; 100 µM, 0,0102; 200 µM, 0,0064. e Valores p exactos: 50 μM, 0,0020; 100 µM, 0,0004; 200 µM, 0,0004. f Intensidad de fluorescencia media de CellROX Green Dye+ en OG1RF tratado con antibióticos en las concentraciones indicadas; MIC concentración inhibitoria mínima. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes. Análisis estadístico mediante análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con prueba de Dunnett versus EtOH; NS no significativo; P <0,05, P <0,005, P <0,0005 y P <0,0001 se indican como *, **, *** y **** respectivamente. Valores p exactos: ERY 0,2× MIC, 0,0432; ERY 0,4× MIC, 0,0002; ERY 2× CIM, <0,0001; ERY 4× CIM, <0,0001; CAM 0,4× MIC, 0,0043; CAM 2× CIM, <0,0001; CAM 4× CIM, <0,0001; AMP 0,2× CIM, 0,0343; TET 0,4× MIC, 0,0285; TET 2× CIM, <0,0001; TET 4× MIC, 0,0063; Menadiona 50 µM, <0,0001; Menadiona 100 µM, <0,0001; Menadiona 200 µM, <0,0001. g La cinética de destrucción celular de varios antibióticos a 10 × MIC revela que los antibióticos que generan ROS no son bactericidas en OG1RF. Los símbolos representan puntos de datos individuales para tres experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. EtOH etanol, eritromicina ERY, cloranfenicol CAM, estreptomicina STR, kanamicina KAN, ampicilina AMP, tetraciclina TET, ciprofloxacina CIP.

Entre los posibles mecanismos para regular la actividad de RlmN, uno implica el estrés oxidativo inducido por antibióticos. RlmN es una enzima radical S-adenosilmetionina (SAM) que contiene un grupo [4Fe-4S] que es sensible a la alteración por especies reactivas de oxígeno (ROS)2. Para probar este modelo, cultivamos OG1RF en presencia del generador de radicales superóxido, menadiona14, en concentraciones subinhibitorias y luego medimos m2A en 23 S rRNA y tRNA. El tratamiento con menadiona provocó una disminución dependiente de la dosis en m2A tanto en ARNr como en ARNt (Fig. 3d, e). Este resultado implica que los macrólidos y el cloranfenicol también indujeron ROS en OG1RF y V583, que evaluamos utilizando la sonda fluorogénica específica de superóxido CellROX Green para cuantificar los niveles de ROS inducidos por antibióticos en OG1RF15. Como se esperaba, tanto la eritromicina como el cloranfenicol aumentaron la fluorescencia de CellROX Green en concentraciones subinhibitorias y más altas (Fig. 3f). Dado el impacto de los antibióticos en la forma y el tamaño de las células bacterianas que pueden generar artefactos en la interpretación de los análisis de citometría de flujo de tintes fluorescentes que detectan ROS y la importancia de establecer puertas FSC y SSC16, confirmamos que los cambios de fluorescencia se debieron al uso de ROS. una sincronización optimizada y otros parámetros de citometría de flujo que minimizan los artefactos en la detección de ROS basada en tintes (Figuras complementarias 5, 6) 15. De hecho, dos observaciones confirman la ausencia de artefactos de tamaño. Primero, la eritromicina redujo los valores medios de FSC-H y SSC-H en concentraciones subinhibitorias (Figura 6 complementaria), lo que sugiere un tamaño de célula más pequeño, aunque la intensidad de fluorescencia media del tinte verde CellROX aumentó directamente con la concentración de eritromicina (Figura 3f). Por otro lado, la ampicilina provocó aumentos en la media de FSC-H y SSC-H (Fig. 6 complementaria), pero no provocó un aumento en la intensidad de fluorescencia media del tinte verde CellROX (Fig. 3f). Estas dos observaciones muestran de manera convincente que los cambios en la fluorescencia inducidos por antibióticos en los estudios del tinte CellROX se debieron a la activación del tinte por ROS y no a artefactos de tamaño de citometría de flujo. No todos los antibióticos dirigidos a ribosomas generan ROS en OG1RF. Las concentraciones subinhibitorias y suprainhibitorias de tetraciclina, que se une a la subunidad 30 S, indujeron un aumento en la fluorescencia de CellROX Green, mientras que los aminoglucósidos estreptomicina y kanamicina no lo hicieron (Fig. 3f). Además, la ampicilina y la ciprofloxacina, mecánicamente distintas, tampoco aumentaron la fluorescencia de CellROX Green en concentraciones subinhibitorias o suprainhibitorias (Fig. 3f). Estas observaciones parecerían contradecir a Léger et al., quienes informaron que los β-lactámicos amoxicilina y cefotaxima causaron la producción de superóxido por reducción de demetilmenaquinona (DMK) en E. faecalis17. Sin embargo, no midieron el superóxido intracelular. Está bien establecido que E. faecalis produce altos niveles de superóxido extracelular a través de DMK unida a membrana y orientada hacia el exterior, pero el superóxido no puede difundirse a través de las paredes celulares y CellRox lo detecta como superóxido intracelular y también se dismuta rápidamente a peróxido de hidrógeno fuera de la célula18; Leger et al. midieron el peróxido de hidrógeno extracelular como su sustituto del superóxido17. Que la actividad de RlmN observada aquí pueda ser causada por una reducción inducida por antibióticos en los niveles de SAM no es posible dada la falta de cambios en las modificaciones basadas en la metilación distintas de m2A. Además, si bien no medimos los niveles de ARNt aquí, la constancia de todos los demás niveles de modificación de ARN confirma que el tratamiento con antibióticos no cambió significativamente los niveles de los sustratos de ARNr y ARNt de RlmN. Aunque nuestros estudios no proporcionan pruebas de una reacción directa de ROS con RlmN, la dosis-respuesta para la inhibición de RlmN con menadiona (Fig. 3e), eritromicina (Figs. 2c, 3f) y ROS inducidas por cloranfenicol (Figs. .2c, 3f) sugiere fuertemente que RlmN es inactivado por superóxido intracelular resultante de la exposición de E. faecalis a macrólidos y cloranfenicol.

Dado el controvertido modelo de que los antibióticos bactericidas comparten un mecanismo común para generar ROS citotóxicos15,19,20, probamos los antibióticos para determinar su actividad bactericida y bacteriostática en E. faecalis. La eritromicina y el cloranfenicol han sido clasificados como bacteriostáticos21, con actividad bactericida a altas concentraciones contra Streptococcus pneumoniae21, mientras que la ciprofloxacina, la ampicilina y la estreptomicina se clasifican como bactericidas21. Sin embargo, nuestros datos muestran que la eritromicina y el cloranfenicol inducen la producción de superóxido en concentraciones bajas en OG1RF, mientras que la ciprofloxacina, la ampicilina y la estreptomicina no. Leger et al. observaron la generación de ROS por la β-lactámica relacionada, la amoxicilina, en concentraciones supraletales, nuevamente midiendo el peróxido de hidrógeno que probablemente se generó a partir del superóxido producido extracelularmente. Para establecer la actividad bactericida, realizamos ensayos de destrucción con OG1RF en presencia de antibióticos a diez veces su CIM y descubrimos que los antibióticos que aumentan la fluorescencia de CellROX Green (es decir, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina) son bacteriostáticos en OG1RF, mientras que ciprofloxacina, ampicilina y la estreptomicina, que no induce ROS, es bactericida (Fig. 3g). Estos datos no sólo refutan aún más el vínculo entre los antibióticos bactericidas, las ROS y la muerte celular, sino que también plantean la cuestión del papel de RlmN en la sensibilidad a los antibióticos de E. faecalis.

A continuación, investigamos el efecto de la actividad de RlmN sobre la sensibilidad a los antibióticos de E. faecalis, utilizando el mutante de eliminación ΔrlmN y una cepa que sobreexpresa RlmN. Aquí creamos un mutante de sobreexpresión constitutiva, OG1RFprlmN, que portaba un plásmido que expresa RlmN bajo el promotor constitutivo de Sortasa A en el vector pGCP12322; y una cepa de control, OG1RFpEmpty, que portaba el mismo plásmido que carecía de la secuencia codificante de RlmN. La sobreexpresión de RlmN no afectó la CIM de eritromicina, estreptomicina, kanamicina, ampicilina, tetraciclina o ciprofloxacina (Tabla complementaria 2), pero sí aumentó 10 veces la sensibilidad de OG1RFprlmN a la destrucción por los antibióticos bactericidas ampicilina y ciprofloxacina ( Figuras 4a, b). Sin embargo, la pérdida de RlmN no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de E. faecalis en presencia de hasta 5 veces la CIM de tipo salvaje para los 5 antibióticos (Tabla complementaria 2, Fig. 4c, d), excepto 16 veces. aumento de la CMI para el cloranfenicol (Fig. 4e, Tabla complementaria 3). En conjunto, (1) la sobreexpresión de RlmN aumenta la sensibilidad de E. faecalis a la ampicilina y la ciprofloxacina y (2) la pérdida de la actividad de RlmN confiere resistencia al cloranfenicol, lo que sugiere que RlmN podría desempeñar un papel en la regulación de la tolerancia a los antibióticos.

Cinética de destrucción celular para OG1RFpEmpty y OG1RFprlmN cultivadas con 5× MIC para ampicilina (5 µg/mL) y ciprofloxacina b 5 µg/mL. Cinética de destrucción celular para OG1RF y ΔrlmN cultivadas con 5X MIC para c 5 µg/ml de ampicilina y d 5 µg/ml de ciprofloxacina. Los gráficos muestran datos individuales de 4 experimentos independientes. e Ensayo de crecimiento para la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cloranfenicol con OG1RF y ΔrlmN. El gráfico muestra datos de 4 réplicas biológicas.

A continuación, definimos los efectos de la actividad RlmN en el proteoma celular. Nuestros resultados establecen que la actividad metiltransferasa de RlmN está atenuada por el superóxido, lo que plantea la posibilidad de que RlmN sirva como un sensor redox que regule la respuesta al estrés celular. Para probar esta idea, realizamos proteómica cuantitativa utilizando etiquetas de masa en tándem (TMT) isobáricas multiplexadas para identificar proteínas expresadas diferencialmente entre OG1RF, ΔrlmN y OG1RF cultivadas en menadiona (Fig. 5a, b; Tabla complementaria 3; Datos complementarios 1). Solo unas pocas proteínas aumentaron en ΔrlmN en comparación con OG1RF tratado con menadiona, lo que sugiere la precisión de RlmN como un interruptor molecular. De hecho, encontramos una correlación positiva de R = 0,900 entre los cambios de proteínas estadísticamente significativos (p <0,05) en ΔrlmN y OG1RF tratados con menadiona (Fig. 5d). Una de ellas fue la enzima de defensa antioxidante, superóxido dismutasa, para la cual existe un solo gen (sodA) en E. faecalis23. Es de destacar que otra conocida enzima de defensa antioxidante, la catalasa (KatA), no se detectó consistentemente en los análisis proteómicos (Datos complementarios 1). Curiosamente, el conjunto común de proteínas que están reguladas negativamente en ambos conjuntos de datos incluye proteínas asociadas con la virulencia (Tabla complementaria 4). La proteína de la subunidad del pilus, EbpA, es un factor de virulencia importante en E. faecalis, implicada en la formación de biopelículas, endocarditis e infección del tracto urinario asociada a catéter24; y proteínas que contienen el dominio WxL25,26, que, en Enterococus faecium, se han implicado en la supervivencia en las sales biliares y en la patogénesis de la endocarditis27.

Gráficos de volcán que muestran cambios en los niveles de proteína en OG1RF causados por una eliminación de rlmN (ΔrlmN) y un tratamiento con b menadiona. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student bilateral. El cambio de log2 (eje x) se trazó frente al −log10 (valor p) (eje y). Un −log10 (valor de p) de umbral de 1,30 (P <0,05) se indica mediante la línea horizontal de puntos, mientras que las líneas de puntos verticales representan valores de cambio de pliegue en ±1 DE. c Proteínas detectadas tanto en los tratados con menadiona como en ΔrlmN sin un valor de corte de P. Correlación de Pearson R = 0,448, valor de p de dos colas < 0,0001. d Proteínas que cambiaron significativamente (P <0,05) tanto en las células tratadas con menadiona como en las células ΔrlmN. El límite se estableció en 1 DE, que es log2 (cambio de veces) de ±0,639 para el tratamiento con menadiona y log2 (cambio de veces) de ±0,443 para ΔrlmN. Los círculos azules representan proteínas que se regulan significativamente hacia arriba o hacia abajo en ambos, en relación con las células de tipo salvaje no tratadas. Estas proteínas se muestran en la Tabla complementaria 4. Los datos mostrados son para tres réplicas biológicas. Los círculos rojos indican superóxido dismutasa (SodA). Correlación de Pearson R = 0,900, valor de p de dos colas 0,0372.

Con base en los resultados presentados aquí, proponemos un mecanismo (Fig. 6) en el que RlmN sirve como un interruptor molecular sensible a ROS que modula las respuestas fisiológicas al estrés oxidativo y confiere resistencia fenotípica al estrés ambiental y a los agentes antimicrobianos. Quizás esto no sea sorprendente dada la importancia de otras proteínas Fe-S, como SoxR, Fnr y aconitasa, como sensores de ROS vinculados a cambios en la expresión genética y el fenotipo celular6. RlmN y m2A están ausentes en los eucariotas y, dentro de los procariotas, RlmN es la única enzima que sintetiza m2A. La inercia del C2 de la adenosina al ataque electrofílico y la baja acidez del protón C2 requieren un intermediario SAM de radical libre. Este mecanismo, claramente diferente de las metiltransferasas típicas dependientes de SAM, es exclusivo de RlmN28 y la metiltransferasa resistente al cloranfenicol-florfenicol (Cfr)29. Aquí demostramos que la actividad de RlmN no solo depende en gran medida de los niveles de superóxido intracelular sino que también regula los niveles de SodA, que promueve la tolerancia a los antibióticos y facilita la supervivencia de los macrófagos en E. faecalis y otras bacterias.

Los factores ambientales, así como ciertos antibióticos, inducen especies reactivas de oxígeno en Enterococcus faecalis. Estos conducen a la inactivación de RlmN mediante la perturbación de su grupo Fe-S, ejerciendo efectos duales tanto en el ribosoma como en el ARNt. m2A (que se muestra en rojo) está presente en la posición 37 de los ARNt seleccionados y el ARNr 23 S en el centro de peptidil transferasa del ribosoma. La pérdida de modificaciones de m2A en el ARNr y el ARNt conduce a un grupo modificado de ribosomas y ARNt, lo que conduce a una regulación positiva de la respuesta antioxidante y una regulación negativa de los factores de virulencia para mejorar la supervivencia en presencia de antibióticos.

Entonces, ¿cómo es que la exposición de E. faecalis a antibióticos que se unen a ribosomas produce niveles elevados de superóxido? Si bien no existe un mecanismo universal por el cual la exposición a antibióticos provoque aumentos en las ROS en las bacterias, a pesar de afirmaciones anteriores20, existen numerosas vías para generar superóxido y otras ROS y para la exposición ambiental de las bacterias a ROS2. E. faecalis genera grandes cantidades de superóxido extracelular18, y Léger et al. demostrando que dosis supraletales de ampicilina aumentan estos niveles17. Si bien no medimos las ROS extracelulares, el superóxido no puede difundirse a través de la pared celular bacteriana y nuestros resultados muestran que ni la amoxicilina subletal ni supraletal ni otros antibióticos bactericidas causan la formación de superóxido intracelular en E. faecalis (Fig. 3f). La forma en que las concentraciones subletales de eritromicina y cloranfenicol hacen que aumenten los niveles de superóxido podría estar relacionada con el estrés celular causado por la inhibición de la traducción o por una mala traducción, y el estrés proteotóxico conduce a un aumento del metabolismo reductor y, por lo tanto, a un aumento del superóxido. El mecanismo de producción de superóxido inducida por eritromicina espera más estudios.

¿Cómo juega un papel el m2A catalizado por RlmN en los cambios fenotípicos causados por la pérdida de RlmN o la exposición al superóxido? Me vienen a la mente dos posibilidades basadas en la actividad de RlmN tanto en el ARNr como en el ARNt. Desde la perspectiva del ARNr, m2A podría facilitar el estancamiento de los ribosomas que conduce a la activación del péptido naciente ErmBL de la expresión de ErmB. RlmN cataliza la formación de m2A en A2503 de 23 S rRNA, un nucleótido conservado que reside en el centro de peptidil transferasa (PTC) del ribosoma cerca de la entrada al canal de salida del polipéptido naciente (Fig. 7) y participa en el ajuste fino. Interacciones ribosoma-péptido naciente, transmitiendo la señal de estancamiento al PTC32. A2503 está muy cerca espacialmente del sitio de unión de eritromicina32, del péptido naciente ErmBL que activa la expresión de ErmB tras la unión del antibiótico33 y del A2058 que ErmB modifica con m6A para evitar la unión del antibiótico (Fig. 7). Aunque especulativa, una hipótesis es que la pérdida de actividad de RlmN reduce m2A2503 y, por lo tanto, facilita la activación de la síntesis de ErmB inducida por ErmBL.

La figura incluye eritromicina (azul), cloranfenicol (rosa), el A2503 modificado con m2A (bola roja) por RlmN y el sitio A2058 modificado con m6A mediado por Erm (bola amarilla).

Desde la perspectiva del ARNt, RlmN es una de las dos únicas metiltransferasas que se sabe que modifican tanto el ARNr como el ARNt11. En E. coli, m2A37 se produce en seis ARNt: tRNAArgICG, tRNAAspQUC, tRNAGlncmnm5sUUG, tRNAGlnCUG, tRNAGlumnm5s2UUC y tRNAHisQUG34. Las modificaciones en la posición 37 son importantes para mantener el marco de lectura35, mientras que la pérdida de RlmN aumenta la lectura del codón de parada36. Es probable que esto último no sea relevante para la síntesis de selenoproteínas en E. faecalis, ya que no hay genes aparentes que codifiquen selenoproteínas en el genoma de E. faecalis37. Se están realizando más estudios para determinar si E. faecalis utiliza la reprogramación del ARNt y la traducción sesgada por codones para regular la expresión de genes de respuesta al estrés como se observa en las micobacterias7.

Finalmente, nuestros resultados plantean la cuestión de la singularidad de la sensibilidad de RlmN a la inactivación por superóxido, en comparación con otras proteínas del grupo Fe-S en E. faecalis y otros organismos. E. faecalis es inusual entre las bacterias comensales y patógenas humanas por carecer de muchas proteínas del grupo Fe-S, como la fumarasa, la aconitasa, la isocitrato deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido tricarboxílico38. Esta falta de ciclo de tricarboxilatos es compartida por Listeria monocytogenes, que también comparte con E. faecalis la falta de formación de ROS cuando se expone a antibióticos bactericidas39. Otras proteínas del grupo Fe-S ausentes en E. faecalis incluyen el regulador del transporte de hierro GrxD, 1 de 3 sistemas para la biogénesis del grupo Fe-S (NIF, ISC y SUF; solo SUF está presente en E. faecalis40) y MiaB. Esto último se ve corroborado por nuestra incapacidad para detectar m2si6A en presencia de i6A (Fig. 1d). Sin embargo, E. faecalis posee varias proteínas del grupo Fe-S, incluidas QueE y QueG, implicadas en la biosíntesis de queuosina (Q)41. Claramente se necesita más trabajo para determinar la generalidad de las proteínas modificadoras de ARN del grupo Fe-S sensibles a ROS en otros organismos y redes de señalización homólogas mediadas por epitranscriptomas. Ciertamente es posible que RlmN sea excepcionalmente sensible como potencial nodo de señalización redox en E. faecalis. Sin embargo, además de MiaB, existen otras enzimas modificadoras de ARN que contienen grupos Fe-S42 que, como RlmN, pueden servir como reguladores de respuesta redox. Un análisis sistemático de las modificaciones del ARN sensible a ROS en diferentes microbios mejoraría nuestra comprensión de las redes de respuesta al estrés oxidativo en las bacterias.

En conclusión, demostramos que la actividad de RlmN no solo depende en gran medida de los niveles de superóxido sino que también regula los niveles de SodA. En E. faecalis y otras bacterias, SodA promueve la tolerancia a los antibióticos30 y facilita la supervivencia en los macrófagos23. En total, RlmN, ampliamente distribuido en todos los géneros de bacterias43, puede servir como un interruptor redox que transmite la detección redox al epitranscriptoma de ARNr y ARNt para la modulación directa de la traducción para una respuesta protectora al estrés oxidativo.

Las cepas de Enterococcus faecalis OG1RF y V583 se cultivan en caldo de soja tríptico (TSB) o se siembran en agar de soja tríptico en condiciones aeróbicas a 37 °C. Todas las cepas mutantes son derivados de OG1RF. La eliminación de rlmN en OG1RF (ΔrlmN) se generó mediante una eliminación en marco de rlmN de OG1RF mediante reemplazo alélico utilizando el vector pGCP21322. Las regiones de 250 pb aguas arriba y aguas abajo de la secuencia codificante de rlmN se amplificaron a partir del ADN genómico de OG1RF y se unieron mediante PCR superpuesta y se insertaron en los sitios XhoI/KpnI de pGCP213 (Tablas complementarias 5 y 6). Este plásmido se transformó en OG1RF y se introdujo en los sitios específicos del cromosoma de la cepa parental mediante reemplazo genético mediado por recombinasa.

El sobreexpresor de RlmN, OG1RFprlmN, se generó mediante la introducción del gen que codifica RlmN en el plásmido pGCP123 bajo el promotor constitutivo de sortasa22. La secuencia codificante para RlmN se amplificó por PCR con una etiqueta His6 en el extremo C y se insertó en los sitios XhoI/NotI de pGCP123 bajo un promotor Sortasa A (Tablas complementarias 5, 6). OG1RFpEmpty es OG1RF que porta el plásmido pGCP123, pero sin introducción del gen que codifica RlmN. Todos los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 5. Todos los cebadores para la clonación y RT-qPCR para producir las cepas mutantes se enumeran en las Tablas complementarias 6 y 7. Todas las construcciones de plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger. Las CIM utilizadas para OG1RF son eritromicina de 1 µg/ml, espiramicina de 1 µg/ml, cloranfenicol de 4 µg/ml, kanamicina de 64 µg/ml, estreptomicina de 128 µg/ml, ampicilina de 1 µg/ml, tetraciclina de 0,5 µg/ml y tetraciclina de 1 µg/ml. ml de ciprofloxacina. Las CIM utilizadas para V583 son >1024 µg/ml de eritromicina, 8 µg/ml de cloranfenicol, 256 µg/ml de gentamicina, 1 µg/ml de ampicilina y 1 µg/ml de ciprofloxacina. OG1RFprlmN y OG1RFpEmpty se cultivan en 500 µg/ml de kanamicina para mantener el plásmido pGCP123.

Un cultivo nocturno se diluyó 1:20 veces y luego se cultivó a 37 °C hasta alcanzar la fase logarítmica media. Este cultivo en fase logarítmica media se diluyó luego 1:20 en medios que contenían concentraciones subletales de antibióticos y se cultivó a 37 °C con agitación a 180 rpm. Los cultivos se cosechan a una densidad óptica (DO600) de ~0,6–0,8 después de 4–5 duplicaciones mediante centrifugación a 4000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El ARN se extrajo y purificó siguiendo a Hia et al.44. Brevemente, se lisaron 100 ml de cultivo bacteriano en presencia de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y acetato de sodio 100 mM, pH 5,0, batiendo perlas con perlas de circonio-sílice de 0,1 mm utilizando Qiagen TissueLyser II durante 12 minutos a 30 Hz. Las especies de ARN grandes y pequeñas se recuperaron diferencialmente utilizando el kit de aislamiento de miARN PureLink (Invitrogen) con 35% de etanol y 70% de etanol respectivamente. Los ARNr 23 S y 16 S se aíslan por separado hasta la pureza de la fracción de ARN grande después de HPLC usando la columna Bio SEC-5 (Agilent; 7,8 mm, longitud: 300 mm, tamaño de partícula: 5 μm, tamaño de poro: 1000 Å); y el ARNt se aisló hasta la pureza de la pequeña fracción de ARN después de HPLC en la columna Bio SEC-3 (Agilent; 7,8 mm, longitud: 300 mm, tamaño de partícula: 5 μm, tamaño de poro: 300 Å). Todas las separaciones se realizaron con acetato de amonio 100 mM, a 60 °C con un caudal de 0,5 ml/min. Los perfiles de elución para todas las muestras se muestran en la figura complementaria 1, que revela muestras altamente purificadas de ARNr y ARNt 16 S y 23 S de alta calidad. Las fracciones de HPLC que contenían las poblaciones de ARN diana se combinaron, concentraron y sometieron a intercambio de tampón en acetato de amonio 10 mM utilizando filtros de exclusión de tamaño de corte de 3000 Da (Millipore). El ARN se cuantificó mediante espectroscopia NanoDrop.

Para la cuantificación de ribonucleósidos, se hidrolizó enzimáticamente ARN (5 µg) durante 4 h a 37 °C con benzonasa (99% de pureza, Novagen 70664), fosfatasa bacteriana (ThermoFisher 18011015) y fosfodiesterasa I (Sigma P3243), en presencia de magnesio. cloruro, antioxidantes e inhibidores de desaminasa, incluyendo desferroxamina (Sigma D9533), hidroxiltolueno butilado (Sigma W218405), pentostatina (Sigma SML0508), tetrahidrouridina (Calbiochem 584222) y estándar interno [15N]5-desoxiadenosina. Las muestras se limpiaron utilizando un filtro de corte de 10 kDa (Nanosep). Las mezclas de ribonucleósidos se resolvieron en una columna analítica Hypersil C18 (2,1 × 100 mm, 1,8 mm; Agilent) montada en un sistema HPLC Agilent 1290 y conectada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6490 mediante monitorización de reacciones múltiples en modo de iones positivos. Los parámetros ESI utilizados fueron temperatura del gas 80 °C; flujo de gas 11 L/min; presión del nebulizador 20 psi; temperatura del gas envolvente 300 °C; voltaje capilar 1800 V; voltaje de la boquilla 2000 V.

Los ribonucleósidos se identificaron utilizando los tiempos de retención de los estándares y las transiciones de masa MS/MS que implican la pérdida de ribosa (136 m/z) o 2'-O-metil-ribosa (146 m/z) (Tabla complementaria 1). Para la cuantificación relativa de modificaciones entre el mismo lote de muestras, la intensidad de la señal se normaliza frente a la intensidad combinada de los cuatro ribonucleósidos canónicos para corregir la variación en las cantidades de ARN. Las señales espectrales también se normalizan frente a un estándar interno enriquecido ([15N]5-2'-desoxiadenosina) para ajustarse a las variaciones en la sensibilidad del instrumento. Para la cuantificación absoluta de m2A y adenosina, se ejecutaron una serie de concentraciones de estándares de nucleósidos para m2A y adenosina con cada lote de muestras para obtener curvas de calibración estándar. Luego se obtuvieron las concentraciones de nucleósidos ajustando las intensidades de señal en las curvas de calibración, y luego se usaron para obtener la relación molar de m2A/A.

La cuantificación absoluta de los niveles de m2A en rRNA y tRNA usando curvas de calibración para adenosina y m2A revela que m2A está presente en 23 S rRNA en una proporción de aproximadamente 0,00025 m2A por adenosina y en una proporción 2,5 veces mayor de 0,001 en tRNA. El nivel de reducción de m2A es idéntico entre ARNr y ARNt, que disminuye diez veces entre E. faecalis no tratada y cultivos cultivados en 100-200 µg/ml de eritromicina (Fig. 1c, d). Calculamos la abundancia de m2A en ARNr y ARNt basándose en ARNr 23 S de 2904 nucleótidos de largo y ARNt típicamente de 76 a 90 nucleótidos de largo, lo que equivale a ~1m2A en 3,6 ARNr 23 S y ~1 en cada 60 ARNt en V583 no tratado cultivado aeróbicamente. .

El ARN total (2 µg) se sometió a eliminación de ADN utilizando el kit TURBO DNA-free (Ambion, Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizaron 600 ng en 15 µl para la transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). El programa de transcripción inversa se ejecutó de la siguiente manera: 25 °C durante 5 min, 42 °C durante 30 min y 85 °C durante 5 min, seguido de un paso de enfriamiento a 4 °C. Luego se realizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en tiempo real de dos pasos utilizando la mezcla maestra BlitzAmp qPCR (MiRxes, Singapur). Las secuencias de cebadores se pueden encontrar en la Tabla complementaria 8. El programa qPCR se ejecutó de la siguiente manera: 95 °C durante 5 min seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s en un Instrumento de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX384 y analizado utilizando el CFX manager 3.1. Se realizó un análisis de la curva de fusión que consta de incrementos de 0,5 °C de 65 a 95 °C para todas las reacciones para determinar la especificidad de los cebadores. RpoA sirvió como control de carga interno.

Como no pudimos detectar RlmN en los análisis proteómicos cuantitativos de TMT, realizamos proteómica dirigida para cuantificar RlmN. Los sedimentos bacterianos de 10 ml de cultivo en fase logarítmica de OG1RF y V583 se resuspendieron en 250 µl de Hepes 50 mM, pH 8, urea 8 M, DTT 1 mM, y se homogeneizaron mediante batido de perlas seguido de clarificación mediante centrifugación a 16.000 x g durante 30 mín. a 4ºC. Después de la cuantificación de la proteína total en el sobrenadante utilizando el ensayo de proteína del ácido bicinconínico (ThermoFisher Scientific), se mezclaron 50 µg de proteína con colorante de carga de SDS-PAGE y se separaron en un gel de SDS-PAGE al 14 %. Después de teñir y decolorar, se cortó y cortó en trozos de 1 a 2 mm un trozo de gel correspondiente a 30–45 kDa, que incluía la proteína objetivo RlmN 40,9 kDa y las proteínas de referencia RpoA 35,05 kda y Gap2 35,77 kDa (Figura complementaria 4). Los trozos de gel se decoloraron, se redujeron y se alquilaron, seguido de digestión con tripsina durante la noche y extracción de péptidos siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de digestión tripsina In-Gel, ThermoFisher Scientific). Los péptidos extraídos se secaron al vacío y se redisolvieron en acetonitrilo al 2% en ácido fórmico al 0,1% en agua.

Luego se logró la cuantificación dirigida de RlmN utilizando primero Skyline (//proteome.gs.washington.edu/software/skyline) para identificar péptidos precursores y transiciones para RlmN y las proteínas de referencia RpoA y Gap2 (Tabla complementaria 8). Analizamos las secuencias de proteínas de OG1RF RlmN, RpoA y Gap2 en un contexto del proteoma OG1RF, buscando péptidos de 8 a 14 aminoácidos de longitud, con las siguientes configuraciones de Skyline: (1) escisión de tripsina; (2) longitud mínima de 7 aminoácidos, longitud máxima de 25 aminoácidos, excluyendo 25 aminoácidos N-terminales; (3) excluyendo péptidos que contienen Cys, Met, His, NXT/NXS, RP/KP; (4) incluir posibles modificaciones estructurales (por ejemplo, carbamidometilo); y (5) modificaciones variables máximas en 3 y pérdidas neutras máximas en 1. Para RlmN, Skyline identificó 3 péptidos objetivo: (1) K.QVIVQEAQDGTVK.Y [67, 79], (2) K.YLFELPDK.N [80, 87], y (3) K.GLAIGAR.H [184, 190], con los péptidos nº 1 y nº 2 seleccionados. Para Gap2, Skyline identificó 5 péptidos diana: (1) K.YDTTQGR.F [46, 52], (2) K.AIGLVIPELNGK.L [215, 226], (3) K.LDGAAQR.V [227, 233] , (4) R.VPVATGSLTELVTVLDK.E [234, 250] y (5) R.TLEYFANL.- [325, 332], con el péptido nº 2 seleccionado. Para RpoA, Skyline identificó 2 péptidos diana: (1) R.EDVTQIILNIK.G [70, 80] y (2) K.LYAEEEK.T [86, 92], con el péptido n.° 1 seleccionado. Los péptidos seleccionados se sintetizaron con una pureza del 90 % y se analizaron mediante LC-MS/MS en una columna analítica Hypersil C18 (2,1 x 100 mm, 1,8 mm; Agilent) montada en un sistema LC Agilent 1290 infinity acoplado a un espectrómetro Agilent 6490 QQQ en positivo. -modo ion. Se utilizó el Optimizador de métodos MRM automatizado para péptidos de Agilent para optimizar las energías de colisión y los voltajes de fragmentación para sus transiciones MRM y se utilizaron péptidos en una concentración de 10 µg/ml para determinar los tiempos de retención. La cromatografía de fase reversa se realizó con un caudal fijo de 0,25 ml/min con un gradiente de agua y acetonitrilo (disolvente B) acidificado con ácido fórmico al 0,1% (v/v). Los gradientes utilizados fueron los siguientes: 0 a 29 % de disolvente B de 0 a 29 min, 29 a 90 % de 29 a 30 min, 90 % durante 38 min, 90 a 0 % de 38 a 39 min y 0 % durante 45 min. . Condiciones de origen: temperatura del gas 325 °C, flujo de gas 10 L/min, nebulizador 32 psi, temperatura del gas envolvente 300 °C, flujo de gas envolvente 11 L/min, capilar 2000 V, carga 500 V. Las columnas se incubaron a 40 °C . Los dos péptidos precursores principales por área de pico y número de transiciones (mínimo 2) se seleccionaron como iones de calificación y cuantificación. Tras la definición de los parámetros analíticos para los péptidos sintéticos, los péptidos extraídos de las rodajas de gel se analizaron en el mismo sistema LC-MS/MS. Las intensidades de señal para cada péptido se normalizaron a la intensidad de señal total para la ejecución de LC-MS/MS para tener en cuenta las diferencias de carga de péptidos y los datos de cambio se calcularon dividiendo las intensidades de señal normalizadas para las muestras tratadas con antibióticos por aquellas en las muestras de control.

CellROX Green (ThermoFisher) es un tinte patentado sensible a la oxidación cuya fluorescencia a 500–550 nm después de la excitación a 488 nm aumenta sustancialmente con la oxidación en presencia de ADNbc. El verde Cellrox reacciona con el radical hidroxilo y el superóxido, pero no con el peróxido de hidrógeno15. Los cultivos en fase logarítmica se diluyeron hasta una DO600 de 0,1 en TSB al 10 % en presencia de menadiona o antibióticos y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, seguido de la adición de CellROX green (final 0,5 µM) durante 30 minutos más a 37 °C. C en oscuridad con agitación a 180 rpm. Las muestras se analizaron utilizando un sistema de muestreo automático HTS en Attune Nxt v4.2.0 (ThermoFisher Scientific) y el caudal se ajustó a 25 µl/min con un volumen de inyección de 30 µl. Las muestras se detectaron con una emisión de paso de banda de 530/30 nm y registraron 50.000 eventos en la puerta bacteriana. La activación se configuró utilizando muestras sin teñir para la población bacteriana mediante dispersión directa (FSC; se correlaciona con el tamaño de la célula) y dispersión lateral (SSC; se correlaciona con la granularidad interna de la célula) de la luz para determinar la fluorescencia de fondo. Los datos fueron analizados con el software Attune Nxt.

Los cultivos frescos en fase logarítmica media (OD600 de 0,6) se diluyeron 1:20 en medio TSB con o sin tratamiento y se cultivaron a 37 °C con agitación a 180 rpm. Los cultivos se cosechan a una densidad óptica (DO600) de ~0,6–0,8 después de 4–5 duplicaciones mediante centrifugación a 4000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en 250 µl de Hepes 50 mM, pH 8, urea 8 M, DTT 1 mM, y se homogeneizaron mediante batido de perlas seguido de clarificación mediante centrifugación a 16.000 x g durante 30 minutos a 4 °C. Después de la cuantificación de proteínas en el sobrenadante utilizando el ensayo de proteínas del ácido bicinconínico (ThermoFisher Scientific), se digirieron 200 µg de proteína con tripsina después de reducirlas con DTT y alquilarlas con yodoacetamida. Después de lavar 3 veces con TEAB 0,5 M seguido de fraccionamiento utilizando el sistema de ultrafiltración de 10 kDa, se marcaron ~100 μg de péptidos digeridos de cada grupo, incluidas dos réplicas biológicas, utilizando el kit de etiquetado de masa isobárico e isotópico TMT de seis plex (ThermoFisher Scientific), que se realizó según las instrucciones del fabricante.

Los péptidos se separaron mediante HPLC de fase inversa (Thermo Easy nLC1000) utilizando una precolumna (de fabricación propia, 6 cm de C18 de 10 µm) y una columna analítica con punta de 5 µm autoempaquetada (15 cm de C18 de 5 µm, nuevo objetivo) sobre un gradiente de 150 minutos antes de la nanoelectropulverización utilizando un espectrómetro de masas QExactive (ThermoFisher). El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo dependiente de los datos. Los parámetros para el MS de escaneo completo fueron los siguientes: resolución de 70 000 en 350–2000 m/z, AGC 3e6 y TI máximo de 50 ms. La exploración MS completa fue seguida por MS/MS para los 15 iones precursores principales en cada ciclo con una NCE de 28 y una exclusión dinámica de 30 s. Se buscaron archivos de datos espectrales de masas sin procesar (.raw) utilizando Proteome Discoverer (ThermoFisher) y Sequest. Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes: tolerancia de masa de 10 ppm para iones precursores; 0,8 Da para tolerancia de masa de iones fragmentados; 2 escisiones perdidas de tripsina; la modificación fija fue la carbamidometilación de cisteína y la etiqueta N-term y Lysine TMT; las modificaciones variables fueron la oxidación de metionina y la fosforilación de serina, treonina y tirosina. En el análisis de datos solo se incluyeron péptidos con una puntuación Scorer ≥2, una intensidad del canal informador >500 y una interferencia de aislamiento ≤30. Los datos de proteómica se presentan en Datos complementarios 1.

Se diluyó un cultivo en fase logarítmica de OG1RF hasta una concentración final de 108 UFC/ml (DO600 ~ 0,1) en caldo de soja tríptico en presencia de antibióticos a 37 °C con agitación. Se extrajeron alícuotas de cada tubo respectivo en varios puntos temporales y se diluyeron en serie hasta 10-8 veces. Se sembró una alícuota (2,5 µl) de cada dilución en agar TSB y se incubó a 37 °C durante la noche, y se contaron las colonias 24 h después de la mancha.

Se realizaron diluciones en serie dobles de antibióticos en TSB en filas separadas de una placa de poliestireno de 96 pocillos (Corning) y cada placa contenía un inóculo de las bacterias respectivas. El inóculo fue una dilución 1:500 de un cultivo en fase logarítmica (OD600 = 0,5) cultivado a 37 °C. La placa se incubó con agitación a 37 °C y la densidad óptica de cada pocillo se midió a una longitud de onda de 600 nm (BIOTEK, Synergy 4). Los valores de MIC se tomaron como la concentración más baja para la cual no se pudo discernir crecimiento (<0,05 OD600) después de 24 h. Todas las pruebas se realizaron tres veces de forma independiente con dos muestras en cada prueba. Los datos de MIC se presentan en la Tabla complementaria 2.

Las cepas OG1RF se cultivaron aeróbicamente en TSB a 37 °C durante aproximadamente 16 h con agitación (180 rpm) seguido de una dilución 1:20 y se cultivaron hasta alcanzar un crecimiento medio logarítmico. Las cepas OG1RFpEmpty y OG1RFprlmN que albergan plásmidos pGCP123 se cultivaron en 500 µg/ml de kanamicina. El cultivo medio logarítmico se diluyó a OD600 ~ 0,06 (~5 × 107 ufc/ml). Se sembró una alícuota para enumerar las unidades formadoras de colonias (ufc) (Tiempo 0) antes de agregar antibióticos con concentraciones finales de 20 µg/ml de ciprofloxacina y 20 µg/ml de ampicilina. Se retiró una alícuota en los momentos indicados y se lavó con PBS estéril. Las células se diluyeron en serie y se sembraron en agar de soja tríptico para enumerar a los supervivientes.

La significación estadística se evaluó mediante pruebas apropiadas utilizando el software Prism 8 (GraphPad), detalladas en las respectivas leyendas de las figuras. Los asteriscos indican el nivel de significación estadística: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos. Los experimentos se repitieron al menos tres veces.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el código de acceso PXD038178. Los datos de origen utilizados para generar gráficos se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Los autores agradecen al Dr. Michael DeMott por su ayuda con el trabajo de proteómica. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Investigación, Oficina del Primer Ministro de Singapur, en el marco de su programa Campus de Excelencia en Investigación y Empresa Tecnológica (CREATE), a través del Grupo de Investigación Interdisciplinario de Resistencia Antimicrobiana de la Alianza Singapur-MIT para la Investigación y la Tecnología. Agradecemos el apoyo financiero de NMRC OFIRG20nov-0079. Las contribuciones de LNL fueron apoyadas por la Fundación Nacional de Investigación y el Ministerio de Educación de Singapur en el marco de su Programa de Centro de Excelencia de Investigación en SCELSE. AS y JL reconocen el apoyo de la beca de posgrado de la Alianza Singapur‐MIT (SMA) y la subvención de nivel 2 del MOE MOE2018-T2-2-13. El trabajo de proteómica se realizó en parte en el Centro Bioanalítico de Ciencias de la Salud Ambiental del MIT, que cuenta con el apoyo de la subvención del Centro P30‐ES002109 del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental con la ayuda del Dr. Michael Demott.

Ameya Sinha

Dirección actual: Helmholtz Center for Infection Research GmbH, Inhoffenstraße 7, 38124, Braunschweig, Alemania

Ling Ning Lam

Dirección actual: Departamento de Biología Oral, Facultad de Odontología de la Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Jiaqi Liang

Dirección actual: Facultad de Química, Ingeniería Química y Biotecnología, Facultad de Ingeniería, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Cheryl Siew Choo Chan

Dirección actual: Análisis crítico para la fabricación de medicina personalizada IRG, Singapur MIT Alliance for Research and Technology, Singapur, Singapur

IRG sobre resistencia a los antimicrobianos, Alianza MIT de Singapur para la investigación y la tecnología, Singapur, Singapur

Wei Lin Lee, Ameya Sinha, Hooi Linn Loo, Jiaqi Liang, Peiying Ho, Liang Cui, Cheryl Siew Choo Chan, Kimberly Ann Kline y Peter Dedon

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Ameya Sinha, Ling Ning Lam y Kimberly Ann Kline

Centro de Ingeniería en Ciencias de la Vida Ambiental de Singapur, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Ling Ning Lam y Kimberly Ann Kline

Departamento de Ciencias Biológicas y Instituto RNA, Universidad de Albany, Albany, Nueva York, EE. UU.

Thomas Begley

Departamento de Microbiología y Medicina Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Ginebra, Ginebra, Suiza

Kimberly Ann Kline

Departamento de Ingeniería Biológica, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Peter Dedón

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Investigación diseñada por WLL, KAK y PD; WLL, AS, LNL, HLL, JL, PH y LC realizaron investigaciones; CSCC y TB contribuyeron con nuevos reactivos/herramientas analíticas; WLL, AS, TB, KAK y PD analizaron los datos, todos los autores participaron en la redacción del manuscrito.

Correspondencia a Peter Dedon.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Reimpresiones y permisos

Lee, WL, Sinha, A., Lam, LN et al. Una enzima de modificación de ARN detecta directamente especies reactivas de oxígeno para la regulación traslacional en Enterococcus faecalis. Nat Comuna 14, 4093 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39790-x

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Recibido: 28 de octubre de 2022

Aceptado: 27 de junio de 2023

Publicado: 11 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39790-x

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