Comparación de tecnologías alternativas de purificación de mAb

Por Jack Vicalvi, científico principal, J2 Biopharm Associates LLC

Hemos visto más mejoras en el desarrollo de procesos posteriores en los últimos 15 años que en los 35 años anteriores. Esta es la primera de una descripción general de dos partes de productos y enfoques innovadores seleccionados con implicaciones universales que han contribuido con mejoras que permiten la fabricación de terapias biológicas de moléculas grandes, como anticuerpos monoclonales (mAb) y vectores virales, con mayores recuperaciones y pureza.

En la Parte 1 examinamos cómo estos productos cambian la forma en que fabricamos mAb, dónde se pueden utilizar en los esquemas de desarrollo de procesos actuales y qué ventajas confieren sobre los métodos anteriores. Abordamos la economía situacional que impulsa el uso de estos productos o enfoques innovadores. Finalmente, nos centramos en los modelos de ampliación de GMP con fines prácticos: si no se amplía, no importa lo bueno que sea.

Diagramas de flujo del proceso de mAb

La clarificación de la cosecha del biorreactor es el primer paso en el proceso posterior; No es el último paso del proceso anterior ya que es esencialmente una purificación de la sustancia farmacológica. Este paso es fundamental para la purificación eficaz del producto de interés; El método tradicional utilizado es la filtración por tamaño simple del material cosechado. Sin embargo, dependiendo de los atributos de calidad críticos (CQA) requeridos, es posible que la filtración basada en el tamaño por sí sola ya no sea adecuada o inevitable.

El uso de dispositivos de filtración cargados (como los filtros 3M SP y ZB o las membranas Millipore DOHC, COHC y XOHC) puede dar como resultado la eliminación inicial de contaminantes altamente cargados, como el ADN de la célula huésped (ADNhc) y algunas proteínas de la célula huésped. (HCP) y virus, mejorando significativamente la eficiencia de captura posterior y, por lo tanto, la recuperación y pureza iniciales. En situaciones en las que la viabilidad celular es baja (<50%) durante la recolección, hay un marcado aumento en los restos de la célula huésped, incluido el ADN, el HCP (incluidas las enzimas proteolíticas) y las partículas virales intracelulares o endógenas, donde una reducción adicional mediante filtración de membrana cargada puede se vuelven significativos durante los pasos de purificación posteriores. En situaciones que implican una baja viabilidad celular, la adición de una endonucleasa, preferiblemente en el biorreactor, durante 1 hora antes de la recolección serviría para reducir la longitud de la cadena de ADN y mejorar significativamente la filtrabilidad. La endonucleasa continúa funcionando durante la clarificación hasta la captura (generalmente de 3 a 8 horas, dependiendo de las condiciones de captura y la velocidad de carga).

En la mayoría de los casos, los mAb no se unen a matrices aniónicas; sin embargo, puede ser necesario ajustar el pH y/o la conductividad de la recolección (nuevamente, preferiblemente en el biorreactor), dependiendo del objetivo de interés, para evitar la unión al filtro o preparar el objetivo para la captura en pasos posteriores. Las condiciones para una recuperación óptima del producto con la máxima reducción de contaminantes deberán determinarse empíricamente para cada mAb.

Cuando se seleccionan filtros de profundidad del tamaño adecuado, la centrifugación se vuelve, en el mejor de los casos, redundante; luego está el problema de la validación de la ampliación y la limpieza, incluso con baldes desechables (costos de bienes de capital y mantenimiento, generación de aerosoles y eliminación de baldes usados). En aquellos casos en los que la filtración no es práctica, el uso de cromatografía de lecho expandido podría ser una opción más factible y económica (consulte la tecnología Rhobust EBA de Upfront).

Normalmente, la etapa de captura empleará una resina de proteína A. Sin embargo, no todos los restos de proteína A son iguales. Algunos se unen a diferentes mAb con distintos grados de especificidad y avidez; por lo tanto, cualquier resina de proteína A que elija debe determinarse empíricamente. Además, hay que considerar la matriz de resina; entre ellas se encuentran las resinas blandas como la agarosa y algunos metacrilatos y las resinas rígidas como el poliestireno o la cerámica. Todos cuentan con amplios expedientes regulatorios.

Las principales diferencias entre las resinas blandas y rígidas están en la velocidad lineal y el consumo de buffer durante la operación. La agarosa es una resina blanda que requiere soporte en la pared o el lecho se hunde, formando una "sonrisa" que produce un borde de ataque durante la elución en columnas de más de 5 cm de ancho. También es un medio de difusión lenta y pierde capacidad e integridad del lecho por encima de 300 cm/h. Además, debido a su naturaleza difusiva, requiere un lavado extenso durante los cambios de tampón, especialmente antes de la elución. Las resinas capto son agarosa reticulada, lo que puede aliviar algunos de estos problemas; sin embargo, la matriz base sigue siendo agarosa, lo que requiere un lavado extenso y velocidades de flujo lentas para permitir la difusión. Las resinas rígidas son más fáciles de empacar, requieren mucho menos lavado y mantienen la integridad del lecho sin soporte de pared. Estas resinas también pueden funcionar a velocidades lineales de 800 a 1200 cm/h sin una pérdida significativa de productividad.

Una alternativa económica a la captura de proteína A es CIEX. Después de un ajuste a pH 6 en el biorreactor antes de la clarificación, la mayoría de los mAb se pueden unir usando una resina de intercambio catiónico, como POROS HS o Toyopearl GigaCap CM. Las resinas CIEX también tienen mucha mayor capacidad que las resinas de Proteína A (aunque la selectividad es reducida). Las resinas CIEX rígidas son capaces de eliminar virus significativamente cuando se operan a una velocidad de 450 a 600 cm/h (eliminación de virus de 3 a 4 log o LRV). Después de la elución selectiva del objetivo, el eluato se puede ajustar para un paso de mantenimiento de pH bajo, como en el paso típico de Proteína A.

Otro método de captura alternativo sería Toyopearl MX-TRP-650M, que utiliza triptófano como ligando de captura. Otras opciones, como la proteína G y los ligandos “boutique”, son significativamente más costosas que la proteína A, lo que plantea mayores riesgos y gastos, especialmente en escenarios de fabricación GMP.

Tabla 1.Comparación del paso de captura de mAb entre resina blanda, rígida y CIEX (resina rígida)

*Mab SelectSure @ $16 000/L = $380 000/columna x 2 (respaldo GMP) = $760 000 + columnas ($40 000-$60 000 cada una).**Mab Capture A @ $10 000/L = $250 000/columna x 2 (respaldo GMP) = $500,000 + columnas ($40,000-$60,000 cada una).***Toyopearl GigaCap CM @ $6,000/L = $150,000/columna x 2 (respaldo GMP) = $300,000 + columnas ($40,000-$60,000 cada una).

El enfoque tradicional aquí es utilizar CIEX. Las mismas consideraciones esbozadas anteriormente también se aplicarían aquí. En el enfoque alternativo en el que se utiliza CIEX como paso de captura, el paso inicial de pulido de mAb suele ser HIC, como una resina de fenilo o butilo. Las más populares son las resinas a base de metacrilato de Tosoh. Estas resinas pueden funcionar a velocidades lineales más altas que las resinas basadas en agarosa, generalmente de 300 a 600 cm/h. En este paso se podría utilizar una resina modal mixta, como CaptoAdhere, Capto MMC o Hydroxy Apatite; Estas resinas también pueden contribuir significativamente a la eliminación viral.

Las columnas HIC generalmente se cargan con el eluato CIEX a una conductividad de 30 a 50 mS/cm (NaCl de 250 a 400 mM) y posteriormente se lavan, eluyen y eliminan con pasos de conductividad decrecientes. Una de las diferencias entre las resinas de agarosa y metacrilato es la tendencia de la agarosa a contraerse en presencia de sales superiores y expandirse en ausencia de sal; los metacrialtos y las resinas rígidas no. La elución del HIC en sal fisiológica también se puede manipular aumentando el pH. Esto establece el siguiente paso en el proceso.

La tendencia aquí es utilizar una columna AIEX. Este paso se opera como un flujo continuo para el mAb, mientras se eliminan los contaminantes residuales que quedan después de la captura y los pasos de pulido inicial, incluidos HCP y ADN, y es importante como un paso importante de eliminación de virus. Normalmente, los contaminantes restantes son muy bajos y, dependiendo del nivel de contaminantes residuales, la columna se puede reemplazar con un dispositivo de membrana.

En este punto del proceso, los contaminantes restantes suelen estar en niveles de µg; esto permite el uso de una resina rígida en una columna de lecho corto (8 a 12 cm) que puede funcionar a alta velocidad lineal (450 a 600 cm/h). Una alternativa podrían ser los dispositivos de membrana Sartobind Q o Emphaze AEX. La ventaja clave de Emphaze AEX es su capacidad de eliminación de virus (de 4 a 7 LRV), que supera la capacidad de LRV de la resina (de 3 a 5 LRV).

Los principales actores aquí son Millipore ViResolve y Asahi-Kasei Planova 20N y BioEX. El filtro Millipore es de placa y marco, mientras que el Asahi-Kasei es un módulo de fibra hueca. La elección depende de la escala final de fabricación. Si la escala del proceso de fabricación permanece por debajo de 5000 L, preferimos el Asahi-Kasei BioEX o Planova 20N ya que no se requiere prefiltro y el dispositivo es más fácil de manejar ya que es autónomo (no se requiere soporte). En volúmenes de fabricación más altos, Millipore ViResolve puede ser más apropiado aunque se requiera un soporte y un prefiltro.

En el TFF tradicional, los filtros se utilizan en un proceso y luego se limpian entre usos con una operación de limpieza in situ (CIP). Esto requiere una inversión significativa en capacidad del sistema, materias primas, energía y tiempo. Aquí hay tres jugadores principales: Millipore, Pall y Repligen. Tanto Millipore como Pall producen membranas multiusos que requieren pasos de validación de limpieza y almacenamiento. El único dispositivo desechable de un solo uso es la línea Repligen TangenX. Los casetes TFF de un solo uso TangenX SIUS de Repligen funcionan como casetes reutilizables con la comodidad de un solo uso a una fracción del costo. Se trata de una alternativa conveniente que se entrega lista para usar con una variedad de tamaños de poro y configuraciones de canales de flujo validados para uso GMP. Se envían pre-desinfectados y empaquetados con NaOH 0,2 M. Estos casetes son compatibles con soportes de Millipore, Pall y Sartorius; Los modelos más nuevos vienen empaquetados en soportes desechables.

Un enfoque alternativo es Cadence Single-Pass TFF (SPTFF) de Pall, una innovadora tecnología patentada que permite una concentración de flujo directo sin recirculación de producto. SPTFF permite una alta concentración de proteínas y anticuerpos sensibles al corte >160 gramos/litro. Lo que hace esto posible es un diseño único de ruta de flujo y la disposición de casetes en serie. Las capacidades de volumen varían desde varios litros hasta miles de litros. El proceso Cadence SPTFF es continuo, produce factores de alta concentración y elimina la necesidad del circuito de recirculación convencional, lo que minimiza los problemas de agregación y no requiere mezcla, minimiza la exposición al corte y permite que el paso SPTFF se combine con otros pasos posteriores del proceso. Los beneficios adicionales del SPTFF sobre el TFF convencional incluyen menores volúmenes de retención del sistema, mayores recuperaciones y menores requisitos de volumen de descarga. Sin embargo, las condiciones de funcionamiento y la configuración del módulo para cualquier proceso TFF de un solo paso deben establecerse mediante pruebas empíricas.

Dado que la cosecha contiene enzimas proteolíticas y restos celulares, estos deben eliminarse lo antes posible. Lo importante es comenzar el proceso con la mejor oportunidad no solo de capturar la molécula objetivo sino también de eliminar tantos contaminantes como sea posible.

En esta etapa deberíamos hablar de columnas, resinas y membranas. Tarpon Biosystems creó las columnas axiales preempaquetadas desechables originales para usar en Xcellerex. Esta tecnología se vendió posteriormente a Repligen y Life Technologies. Repligen rediseñó las columnas y ahora ofrece columnas desechables preempaquetadas Opus que van desde 50 µL hasta 150 L (80 cm de diámetro). Se pueden empaquetar con resina especificada por el usuario (más de 300 resinas disponibles) con una variedad de alturas de lecho de 0,25 a 30 cm. Las columnas Sepragen Radial Flow (Superflo) funcionan de cuatro a 10 veces más rápido a una presión operativa más baja con volúmenes de piscina más bajos que las columnas axiales convencionales y están disponibles en formatos preempaquetados.

Las resinas rígidas son más fáciles de empacar, requieren mucho menos lavado y mantienen la integridad del lecho sin soporte de pared. Estas resinas también pueden funcionar a altas velocidades lineales (800 a 1200 cm/h) sin una pérdida significativa de productividad. Pall Danaher comercializa una plataforma de cromatografía basada en fibra obtenida mediante la adquisición de Puridify de Cytiva. Este formato de fibra tiene una estructura de poros abiertos que permite el transporte de masa por convección, lo que genera capacidades de unión independientes del caudal y tiempos de ciclo de minutos en comparación con las horas de la cromatografía de resina tradicional. Estas membranas y fibras se pueden utilizar para ciclos rápidos en un solo lote antes de su eliminación.

El paso de captura mediante resina de afinidad es la mejor opción para los mAb. La afinidad permite una mayor reducción de HCP y hcDNA como flujo continuo. La elección de la composición de la matriz también contribuirá a la eliminación o retención de contaminantes y puede eliminar o aumentar la necesidad de una purificación adicional aguas abajo de cualquier paso.

El orden que sigue al paso de captura generalmente viene dictado por las condiciones de elución del paso anterior. Esto reduce la manipulación de buffers entre pasos, evitando pasos TFF innecesarios. Es posible que se requieran algunas diluciones de tampón para alterar la conductividad o el pH del paso de elución anterior y, cuando sea posible, deben manipularse en tanques de mezcla, especialmente para los pasos de unión-elución. Los pasos de flujo generalmente se reservan para el último paso antes del TFF, ya que tienden a aumentar el volumen de la sustancia farmacológica. El uso de membranas versus resinas en los pasos de flujo ayuda a reducir el aumento de volumen resultante y acortar el paso de concentración de TFF.

Elegir el límite de peso molecular adecuado para la membrana TFF es fundamental. Para los mAb (150 a 180 kD) suele ser 100 kD, aunque hay casos en los que se encuentran mAb más pequeños (<120 kD) que requieren un límite más estricto (50 a 70 kD). Las membranas de 10 a 30 kD simplemente no tienen tamaños de poro que sean lo suficientemente grandes como para permitir el paso de la mayoría de los HCP (<60 kD) y las cadenas ligeras (25 a 50 kD).

Por último, el factor clave en cualquier estrategia de purificación es el costo. Considere siempre los costos de fabricación al diseñar su método. Aumentos relativamente pequeños en el costo durante la PD pueden resultar en grandes ahorros durante la fabricación cuando se eligen sabiamente. Siempre que seleccione un paso en particular (resina o membrana), considere siempre el costo de fabricación GMP (validación, tiempo de suite, consumo de buffer, etc.). Deje siempre que sus atributos críticos de calidad impulsen el desarrollo del proceso. Optar por el camino más fácil o menos costoso desde el principio suele volverse en su contra más adelante.

Referencias:

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Sobre el Autor

Jack Vicalvi es científico principal y director de desarrollo de procesos posteriores en J2 Biopharm Associates, una firma consultora, donde asesora a compañías biofarmacéuticas sobre procesos de fabricación GMP y brinda soporte para presentaciones regulatorias. Antes de eso, trabajó para Pall Life Sciences como científico principal y gerente de desarrollo de procesos posteriores. Anteriormente, sus puestos incluyeron puestos de liderazgo e investigación en Goodwin Biotechnology, Xcellerex, Exact Labs, Catalent y Sunovion Pharmaceuticals. Realizó sus estudios universitarios en St. Anselm College, seguidos de programas de posgrado en inmunología en la Southern Illinois University y parasitología en Vanderbilt. Conéctese con él en LinkedIn.

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