Revelando los secretos de un 2900

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13092 (2023) Citar este artículo

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El reciente desarrollo de técnicas para secuenciar ADN antiguo ha proporcionado información valiosa sobre las civilizaciones que nos precedieron. Sin embargo, aún no se ha aprovechado todo el potencial de estos métodos. Extrajimos ADN antiguo de una superficie de fractura recientemente expuesta de un ladrillo de arcilla procedente del palacio del rey Ashurnasirpal II (883–859 a. C.) en Nimrud, Irak. Detectamos 34 grupos taxonómicos únicos de plantas. Con esta investigación hemos realizado el descubrimiento pionero de que el ADN antiguo, efectivamente protegido de la contaminación dentro de una masa de arcilla, puede extraerse con éxito de un ladrillo de arcilla de 2.900 años de antigüedad. Alentamos futuras investigaciones sobre este tema, ya que las perspectivas científicas de este enfoque son sustanciales y podrían conducir a una comprensión más profunda de las civilizaciones antiguas y perdidas.

Cerca del río Tigris, en las afueras de la antigua ciudad de Kalhu, conocida hoy como Nimrud, un fabricante de ladrillos preparó una vez ladrillos de arcilla para la construcción de un nuevo palacio dedicado a su rey Ashurnasirpal II (aproximadamente 883–859 a. C.). Lo que no sabía era que casi 2900 años después, este insignificante ladrillo de arcilla serviría como una cápsula del tiempo única que revelaría detalles de la flora de esta zona y época específicas, a través de la investigación moderna del ADN antiguo oculto y preservado durante miles de años. años.

Esta investigación presenta el descubrimiento de ADN antiguo (ADNa) en muestras de un ladrillo de arcilla de aproximadamente 2900 años de antigüedad conservado en el Museo Nacional de Dinamarca. Al mostrar una aplicación novedosa del análisis de ADNa y sus resultados, proporcionamos una discusión de la flora identificada en relación con la rica abundancia de evidencia textual disponible de la antigua Mesopotamia (aproximadamente lo que hoy es Irak y Siria) para situar nuestros hallazgos en discusiones actuales más amplias sobre la domesticación de plantas en esta zona. El ladrillo en cuestión (número de museo 13854) fue donado al Museo Nacional de Dinamarca en 1958 por la Fundación Rask Ørsted. Fue descubierto durante las excavaciones británicas de Nimrud, que comenzaron en 1949. El asiriólogo Jørgen Læssøe aseguró el apoyo financiero de la Fundación Rask Ørsted, financiada por el estado, lo que hizo posible que él y otros daneses participaran en las excavaciones. En 1958, el Museo Nacional recibió un grupo de objetos de Nimrud, incluido el ladrillo en cuestión, en agradecimiento al apoyo. En el momento en que entró en la colección del Museo Nacional de Dinamarca, ya se había roto en dos pedazos horizontalmente. Debido a su estado, los adobes son aparentemente sólidos, pero de naturaleza delicada. Lamentablemente, durante una manipulación controlada en 2020, la mitad inferior del ladrillo se partió verticalmente en dos pedazos. Este evento presentó una oportunidad para un estudio científico de arcilla no contaminada que podría fecharse con relativa certeza. Fue de esta nueva rotura no contaminada de donde se extrajeron las muestras para este estudio (Fig. 1).

El ladrillo de arcilla del que derivaron las muestras. Imágenes del ladrillo de arcilla del Museo Nacional de Dinamarca (número de museo 13854) y los cinco puntos de muestreo en la superficie de la rotura. El cuadrado amarillo en la parte superior de la figura representa la pieza del ladrillo que se ilustra a continuación.

Hecho principalmente de barro recolectado localmente cerca del río Tigris, mezclado con algún material botánico como paja o paja, o estiércol de animales, el ladrillo fue moldeado en un molde antes de que se le inscribieran los llamados signos cuneiformes, registrando un dialecto del ahora lengua semítica extinta, el acadio, tras lo cual se colocaba al sol para que se secara1,2. Los ladrillos de adobe con inscripciones cuneiformes se utilizaron tradicionalmente para la construcción de edificios monumentales por los gobernantes de la antigua Mesopotamia desde finales del tercer milenio hasta finales del primer milenio a. C., y hoy se conocen miles de estos ladrillos. Es posible datar este ladrillo en concreto dentro de una década debido a su inscripción, que lo identifica como: “Propiedad del palacio de Ashurnasirpal, rey de Asiria”. El texto también proporciona al rey una genealogía que lo ubica cronológicamente en una lista de gobernantes conocidos. La construcción del palacio de Ashurnasirpal II en la antigua Kalhu (actual Nimrud), conocido hoy como el palacio del Noroeste, celebró la ciudad como la nueva capital de Asiria en los albores del Imperio neoasirio, y su construcción se inició alrededor 879 a. C.3. La cronología absoluta del período neoasirio (ca. 883-612 a. C.) está en gran parte bien establecida y se basa en listas conservadas en tablillas de arcilla cuneiformes, a partir de las cuales es posible correlacionar los años del reinado de un rey con el nombre de un funcionario específico de su gobierno4. Estos datos están vinculados a eventos astronómicos registrados en fechas específicas, especialmente en el siglo VII a.C.5. Los datos que obtuvimos de este ladrillo presentaron una oportunidad completamente nueva para estudiar diferentes aspectos del siglo IX a.C.

El primer uso de ADN antiguo (ADNa) se remonta a 1984, cuando por primera vez se secuenció tejido muscular seco de una especie extinta a partir de especímenes de museo6. Desde entonces, los estudios de ADNa han permitido una mirada única hacia atrás en el tiempo, al contenido genómico de especies animales extintas, los humanos, así como estudios arqueozoológicos y arqueobotánicos de diversos especímenes preservados7. Nuestro estudio representa un nuevo material a partir del cual se puede analizar el ADN en forma de ladrillo de arcilla. El ADN antiguo es difícil de extraer debido a su baja concentración y alto grado de fragmentación, pero en este estudio fue posible analizar el ADNa con un vínculo directo con el contexto y la fecha, lo que nos permitió correlacionarlo con evidencia textual aproximadamente contemporánea para presentar plantas vivas.

La ciudad de Kalhu ha ocupado un lugar destacado en el estudio del antiguo Cercano Oriente debido a su historia de excavaciones. A partir de 1845, Sir Austen Henry Layard llevó a cabo las primeras excavaciones en el sitio, y fue sólo la segunda ciudad antigua mesopotámica desenterrada en ese momento. Los hallazgos formaron la base de gran parte del conocimiento inicial sobre la llamada “Cuna de la Civilización” que dio forma al tema de la Asiriología. El sitio fue explorado periódicamente después del trabajo de campo de Layard, por ejemplo, desde 1949 en adelante por el destacado arqueólogo británico Max Mallowan junto con su esposa y famosa autora, Agatha Christie. En la última década, los restos del palacio del Noroeste han sido parcialmente destruidos debido a los recientes disturbios en el norte de Irak y gran parte de Siria.

Mediante la extracción y secuenciación del ADN del ladrillo de arcilla (ver Materiales y métodos) y el siguiente análisis de datos, pudimos detectar 34 grupos taxonómicos únicos de plantas que representan el orden Laurales, así como siete familias distintas de otros órdenes: Apiaceae (subfamilia Apioideae, tribu Selineae), Betulaceae, Brassicaceae (incluido el género Brassica), Ericaceae (incluidas las subfamilias Ericoidae y Vaccinioideae), Poaceae (tribu Poeae y Triticeae), Fagaceae (género Quercus) y Salicaceae (Tabla 1).

El mayor número de identificaciones se realizó en la muestra 5, seguida de las muestras 2 y 4, mientras que la muestra 3 se descartó porque no se pudo obtener un resultado de secuenciación satisfactorio. Las secuencias de plantas más abundantes fueron de las familias Brassicaceae (repollo) y Ericaceae (brezo). Además, se observaron contribuciones de las familias Betulaceae (abedul), Lauraceae (laureles), Selineae (umbelificadores) y Triticeae (pastos cultivados).

Las muestras de control de los bancos de trabajo utilizados mediante extracción de ADN, la muestra de extracción de ADN negativa y los controles de PCR negativos no produjeron amplificación del ADN de la planta ni lecturas de secuenciación después de su inclusión en la secuenciación de Nanopore.

Todas las muestras también se analizaron con un código de barras de ADN corto dirigido a vertebrados para identificar fuentes potenciales de contaminación del ADN moderno. A partir de estos análisis, las fuentes principales identificadas fueron humanas y porcinas, las cuales se observaron esporádicamente en todas las muestras. Con base en esta observación, los resultados de este código de barras de ADN no se analizaron más a fondo, debido a la probabilidad de que los rastros de ADN modernos oscurezcan los posibles resultados de ADNa.

Además, los extractos de ADN restantes de las muestras 2 y 5 se prepararon para secuenciación metagenómica para intentar verificar los resultados como rastros de ADN antiguos, investigando los daños característicos por desaminación en los extremos de las moléculas de ADNa. Sin embargo, no fue posible obtener suficientes lecturas de alta calidad para realizar este análisis de manera confiable. La curación manual de las 105.000 lecturas obtenidas después de 16 h de secuenciación Nanopore reveló que aprox. El 0,1% de las lecturas obtenidas pudieron asignarse a especies de plantas pertenecientes a los grupos taxonómicos observados con la secuenciación de amplicones, con una fuerza estadística relativamente alta, debido a su corta longitud (30-140 pb).

Análisis anteriores de la flora del Iraq actual muestran >3300 especies en 908 géneros pertenecientes a 136 familias de plantas con flores8.

El análisis de ADNa mostró especies de plantas de siete familias distintas, excluyendo los hallazgos del orden Laurales, ya que estas secuencias no se pudieron definir con seguridad a nivel familiar. Reconocemos que algunos de los grupos taxonómicos de plantas observados tienen una amplia distribución en todo el planeta, lo cual es una limitación de nuestro estudio dado que no se pudo generar evidencia directa de rastros de ADN antiguos. Sin embargo, los estrictos controles y el tratamiento de los datos sugieren firmemente que las secuencias de ADN obtenidas de las plantas se originaron a partir del ladrillo de arcilla, y discutiremos los resultados en consonancia con esto. Entre ellas se incluyen las Apiaceae, una familia de hierbas con más de 200 géneros y 3.000 especies9, de las cuales 155 especies están representadas en el Iraq actual, incluidas siete especies endémicas8. Detectamos secuencias de la tribu Selineae, perteneciente a la familia Apiaceae, en nuestras muestras. Una variedad de estas especies que se encuentran en Irak son plantas alimenticias como Daucus (zanahoria), Pastinaca (chirivía), Apium (apio), algunas de las cuales contienen venenos alcaloides letales (Conium spp.), mientras que otras se usan para cocinar, así como modernas. fines medicinales diurnos (Carum, Foeniculum, Pimpinella, Anethum spp.).

La familia de los abedules, Betulaceae, es una familia de árboles y arbustos de hoja caduca que consta de seis géneros10 con un solo género, Betula, y una especie, Betula pendula, que se encuentra hoy en Irak11. Detectamos secuencias de ADN de la familia de los abedules, Betulaceae, en nuestras muestras. Con una sola especie, Betula pendula, representada en la composición botánica del actual Irak11, y suponiendo que el paso de 2900 años no haya provocado una reducción en el número de especies pertenecientes al género Betula en Irak, podemos sugerir una identificación de la especie Betula pendula en nuestras muestras.

La familia Salicaceae contiene árboles y arbustos caducifolios dioicos de madera blanda y clara, y comprende de tres a cuatro géneros y más de 500 especies, con dos géneros, Salix (sauce) y Populus (álamo), representados en el actual Irak11.

La familia Fagaceae está formada por árboles o arbustos de hoja caduca o perenne con hojas simples y alternas y tiene seis géneros y más de 800 especies, de las cuales sólo cuatro especies de un género, Quercus (roble), están presentes en Irak hoy en día11. Por lo tanto, aludimos que nuestras muestras podrían haber contenido una o más de las cuatro especies siguientes: Q. libani, Q. infectoria, Q. macranthera y Q. aegilops8,11.

La familia de la mostaza o de la col, o Brassicaceae (Cruciferae), contiene 338 géneros y 3709 especies12, y está representada con 79 géneros y 195 especies, incluidas diez especies endémicas en el actual Irak8. Identificamos secuencias de ADN del género Brassica en las muestras. Brassica incluye hortalizas como la col, la col rizada, el brócoli, la coliflor, cultivos de raíces y tallos como el rábano, el rábano picante, los nabos, el colinabo y cultivos de semillas como las semillas de mostaza y la colza13. En el actual Irak se pueden encontrar ocho especies pertenecientes a Brassica (cuatro nativas y cuatro cultivadas): B. deflexa, B. nigra, B. juncea, B. tournefortii, así como B. oleracea, B. rapa, B. napus y B. elongata14.

La familia Poaceae (familia de las gramíneas) incluye 11.500 especies15, de las cuales 101 géneros con un total de 264 especies, incluidas tres especies endémicas, se pueden encontrar hoy en Irak8. Identificamos secuencias de ADN de las tribus Poeae y Triticeae en nuestras muestras. El género Poa pertenece a la tribu Poeae con 11-12 especies representadas en el actual Irak16. La tribu Triticeae contiene varias de las gramíneas importantes como el trigo, el centeno y la cebada. En el Iraq actual están representados 12 géneros de la tribu Triticeae, como Tricitum (trigo), Hordeum (cebada) y Secale (centeno)16.

La familia de los brezos, Ericaceae, con > 100 géneros y > 4400 especies, es una familia muy diversa con formas de vida que van desde árboles hasta epífitas y pequeños arbustos hasta hierbas sin clorofila17,18. Identificamos secuencias de ADN que pertenecen a las subfamilias Ericoidae y Vaccinioideae en nuestras muestras.

Laurales, un orden de árboles o arbustos en su mayoría tropicales, a menudo con madera perfumada de gran durabilidad, está compuesto por siete familias que contienen 100 géneros con aproximadamente 2500–2800 especies19. Las siete familias son Atherospermataceae, Calycanthaceae, Gomortegaceae, Hernandiaceae, Lauraceae, Monimiaceae y Siparunaceae19.

El estudio de la antigua Mesopotamia, “la cuna de la civilización”, se basa principalmente en la investigación de fuentes escritas y material arqueológico. Los investigadores tienen disponible un corpus sustancial de fuentes escritas, que consta de decenas de miles de tablillas de arcilla inscritas en escritura cuneiforme que registran las antiguas lenguas acadia y sumeria de ca. 3200 a. C.-75 d. C. En comparación con otros materiales arqueológicos de la misma época, las tablillas de arcilla se conservan extraordinariamente bien. Sin embargo, hasta ahora ha sido un desafío identificar las especies de plantas descritas en la literatura cuneiforme antigua, ya que los términos y conceptos difieren de los nombres de las especies aplicados por la ciencia moderna. Además, sólo disponemos de representaciones visuales limitadas de la flora y la fauna antiguas. Esta brecha en el conocimiento es problemática para el estudio de la medicina antigua, ya que conocemos los nombres antiguos de muchos ingredientes farmacéuticos de los textos cuneiformes, pero aún tenemos que identificarlos correctamente en un contexto moderno. Con la introducción del análisis del ADNa como herramienta complementaria al proceso de identificación de especies presentes en las antiguas civilizaciones mesopotámicas, este campo de investigación podría desarrollarse considerablemente en los próximos años. Además, futuras exploraciones del método presentado aquí en civilizaciones vecinas permitirían investigaciones similares en otras disciplinas antiguas.

Nos han transmitido multitud de términos para referirse a la antigua flora iraquí. Especialmente los textos del segundo y primer milenio a. C. son útiles para discutir nuestros datos en relación con la terminología antigua, ya que estos escritos nos brindan mucho conocimiento sobre productos agrícolas, así como sobre ingredientes utilizados en recetas médicas, mezclas farmacéuticas y diversos rituales. En particular, dos textos ofrecen evidencia útil de una amplia variedad de plantas de jardín, a saber, una lista de plantas importadas y varios artículos servidos durante las festividades inaugurales de Ashurnasirpal II en relación con su palacio, así como una lista de plantas del jardín del rey babilónico. Marduk-apla-iddina (Merodac-Baladan bíblico) en el siglo VIII a. C.20,21.

Trabajos anteriores que correlacionan términos modernos para plantas con palabras antiguas se han centrado principalmente en identificar palabras afines en árabe, arameo y hebreo22, aunque este enfoque tiene un potencial limitado para vincular la terminología antigua con especies biológicas exactas. Esta investigación proporciona una solución parcial para superar los problemas inherentes al intentar identificar grupos taxonómicos concretos de plantas a través de la lingüística. Nuestro estudio identifica la presencia de familias específicas de flora antigua en una región confinada durante un período de tiempo limitado, aunque no proporciona términos antiguos para estos hallazgos. A continuación, analizamos nuestros resultados más relevantes y los asignamos a términos acadios para la flora antigua lo mejor que podemos con el estado actual del conocimiento. Al mismo tiempo, ofrecemos una revisión del impacto de nuestros hallazgos en la historia de la domesticación de plantas específicas.

Curiosamente, una variedad de grupos taxonómicos de flora identificados en nuestro estudio son poco comunes en la documentación cuneiforme, probablemente porque no se cultivaron ni circularon a una escala más amplia en los principales centros administrativos del primer milenio a. C. que empleaban escritura cuneiforme. Por lo tanto, nuestros resultados pueden no ser representativos de los enfoques burocráticos de las unidades administrativas o templos de la época23, en caso de que las plantas no formaran parte de una dieta o cultivo bajo la administración central. Además, es de esperar que algunas taxonomías de plantas antiguas difieran de la clasificación biológica moderna. En la antigüedad, Ashurnasirpal II estableció una especie de jardín zoológico en Nimrud con animales exóticos, y también importó numerosas plantas de regiones de todo Medio Oriente para remodelar el paisaje agrícola de la región21,24,25. Sin embargo, es posible que sus iniciativas no se implementaran adecuadamente antes de que se completara el palacio. Por lo tanto, sigue siendo plausible que nuestros hallazgos representen la flora local de la región de Nimrud en el siglo IX a. C., aunque algunas de las familias de plantas no estaban representadas en la literatura administrativa de la época.

Identificamos nueve grupos taxonómicos relacionados con la familia de las coles Brassicaceae, de los cuales uno podría asignarse al género Brassica. El momento y el lugar exactos de la domesticación del repollo aún no están claros, aunque un estudio reciente sugiere que pudo haber ocurrido en las áreas del centro-norte y noreste del Mediterráneo en la primera mitad del primer milenio a.C.26. Esta conclusión se basó en la ausencia de evidencia, ya que las fuentes textuales y las representaciones de cultivos de repollo, col rizada y coles del antiguo Cercano Oriente se nos han escapado en gran medida26. Sabemos que en el primer milenio a.C. en Irak se cultivaban y consumían varios tipos de verduras, generalmente identificadas como lechuga27. Es de destacar que varios tipos de col rizada, silvestres y domesticadas, son similares en apariencia a la lechuga (por ejemplo, Brassica oleracea). Debido a que uno o más términos que designan los cultivos de repollo, col rizada y col parecen faltar en acadio, aunque nuestros resultados indican que tales especies estaban presentes en el norte de Irak en el siglo IX a. C., parece probable que debamos buscar términos para este tipo de verde entre la terminología para lechuga. Un ejemplo incluye la planta llamada ḪI.IZ.TUR en sumerio, que se equiparaba con los verdes acadios guzāzu y murāru en las listas léxicas. El nombre de esta última verdura proviene de la palabra “amarga”, que tentativamente se ha traducido como “lechuga amarga”. Sin embargo, la única certeza es que estas plantas eran verdes que podían cultivarse y consumirse. Sobre la base de nuestros hallazgos, se podría proponer correlacionar el sabor amargo del repollo con el nombre murāru. Por lo tanto, tal vez debería modificarse la afirmación de que los textos cuneiformes antiguos no incluyen el repollo, la col rizada o los cultivos de coles, ya que en realidad enumeran tipos de lechuga, como la murāru, que también podría identificarse como un tipo de repollo28.

Otra categoría de plantas representadas en el género Brassica es la mostaza. El término acadio kasû (sumerio GAZIsar) ha sido interpretado como “mostaza”29. Según fuentes escritas, se cultivó en grandes cantidades en diferentes épocas y la planta, así como sus productos, podían utilizarse como aromatizantes. Sin embargo, las descripciones de la apariencia de la planta no coinciden exactamente con las de las especies nativas de mostaza conocidas en Irak. En consecuencia, varios investigadores prefieren identificar la planta como, por ejemplo, remolacha, cuscuta, regaliz silvestre o tamarindo, como lo discutió recientemente Eypper30. Aun así, ninguna de las alternativas encaja perfectamente con las descripciones del kasû, y no se puede descartar que las descripciones de la apariencia de la planta kasû puedan encajar con una especie de mostaza nativa de Irak.

Una especie como el rábano (Raphanus sativus), perteneciente a la familia Brassicaceae detectada en nuestras muestras, no está ampliamente documentada en la documentación cuneiforme, aunque una palabra probablemente identificada como una forma de rábano, puglu, se aplica en cartas y documentos administrativos de la segunda mitad del tercer milenio a.C. y en algunos textos del primer milenio a.C., entre ellos al menos un texto médico27,31.

La identificación de varias secuencias de ADN pertenecientes a la familia de las coles (Brassicaceae) en el ladrillo de arcilla investigado (Fig. 1), sugiere que la conclusión teórica de Maggioni et al.26, que sitúa el origen de los cultivos de coles en el norte del Mediterráneo, puede necesitan ser modificados32. Aunque estos cultivos pueden haberse originado allí, seguramente estuvieron presentes en el siglo IX a. C. en el norte de Irak, lo que es anterior a la evidencia principalmente lingüística presentada por Maggioni et al.26. Aún no se sabe si nuestros hallazgos representan plantas silvestres o plantas domesticadas que crecen en las orillas del Tigris.

La identificación de ADNa en nuestras muestras de la familia Poaceae, tribu Triticeae, podría ser indicativo de la presencia de una especie como Triticum aestivum. El trigo harinero (Triticum aestivum) tiene una historia de domesticación que se remonta al menos a 10.000 años33. Mediante el cultivo de otras especies de trigo, como el escanda y el escanda, la planta fue domesticada durante miles de años antes de la invención de la escritura en el antiguo Irak34. En lengua acadia, el trigo se llamaba kibtu (sumerio ŠE.GIG), aunque en un período pudo haber sido conocido como aršātu. En la época de Nimrud35 se descubrieron granos de escanda y de trigo harinero. El trigo se produjo desde la invención de la escritura, y continuamente encontramos referencias en los textos al grano y a diversos métodos de producción36. El corazón de la antigua Asiria, incluida Nimrud, en la parte norte del actual Irak, está ubicado en una zona climática que periódicamente podría sustentar cultivos de secano. Sin embargo, como han demostrado investigaciones recientes, el corazón de la antigua Asiria experimentó niveles elevados de precipitación en la época de Ashurnasirpal II37, lo que podría, en principio, haber proporcionado condiciones más favorables para el cultivo de trigo harinero y cultivos asociados.

Esta investigación demuestra que la extracción de ADN de un ladrillo de arcilla permite la detección de una variedad de grupos taxonómicos presentes en el momento y lugar determinados en que se fabricó el ladrillo. El ladrillo de arcilla sirve como una cápsula del tiempo que proporciona una visión única de la biodiversidad de un momento y lugar específicos.

Es bastante seguro que la arcilla utilizada para crear el ladrillo analizado en el presente estudio data alrededor del año 879 a. C. debido a la inscripción en el ladrillo, y que la arcilla debe haber sido recolectada en el área que rodea la ciudad de Nimrud. Esta información estuvo disponible en las fuentes históricas que explican cómo se inició la construcción del palacio alrededor del 879 a. C., así como descripciones de la práctica general de creación de adobes. Lo que se desconoce es cómo acabó el ADN detectado en esta masa particular de arcilla. Esto desafía la interpretación de los resultados, ya que simplemente es posible describir la presencia/ausencia de especies con nuestro método. Sin embargo, cuando los datos se combinan e interpretan junto con el conocimiento adquirido a partir de numerosas fuentes históricas contemporáneas escritas, la información proporcionada por este método es muy aplicable y constituye una contribución importante al estudio de las civilizaciones antiguas.

El uso de objetos arqueológicos como fuente de ADNa no está exento de obstáculos, ya que los métodos para recolectar muestras son invasivos y a menudo dañan o incluso destruyen el objeto, por ejemplo un diente, sin dejar nada para que las generaciones futuras lo aprecien y estudien. Nuestro descubrimiento proporciona un enfoque completamente nuevo, ya que el material histórico hecho de arcilla procedente de la antigua Mesopotamia es muy abundante, y la ubicación y el período de tiempo de los artefactos se pueden determinar a través de las inscripciones cuneiformes en los objetos y el conocimiento de los sitios arqueológicos donde se encuentran. fueron descubiertos. Además, animamos a futuros estudios a desarrollar métodos para obtener muestras del núcleo de ladrillos o tabletas sin destruir los objetos, dejando sólo un mínimo de daño visible. La extracción de muestras del núcleo del ladrillo proporcionaría la seguridad de que las muestras provienen de un ambiente protegido y, por lo tanto, no contaminado dentro de la masa de arcilla.

El desarrollo cada vez más acelerado de la tecnología de secuenciación ha hecho que el análisis de ADN sea más accesible que nunca. Tanto la secuenciación de amplicones de marcadores genéticos cortos como la secuenciación metagenómica de escopeta se están aplicando a diversos materiales antiguos y degradados para dilucidar la composición taxonómica de nuestro pasado.

El estudio presentado utiliza un protocolo modificado que se ha aplicado previamente a materiales como el hueso, considerando que las muestras de arcilla son porosas con alta afinidad hacia los ácidos nucleicos. Esto requirió un enfoque suave para extraer el ADN sin degradarlo aún más mediante la aplicación de tratamientos severos. El método aplicado logró extraer ADN vegetal de muestras de un ladrillo de arcilla.

La elección del método de secuenciación del ADN y del análisis bioinformático también tiene implicaciones para los resultados que se pueden obtener38. La secuenciación metagenómica de escopeta captura fragmentos cortos de ADN de todo el material genómico en una muestra determinada y, en teoría, es capaz de capturar una imagen más representativa del contenido taxonómico del material analizado. Sin embargo, las bases de datos disponibles están sesgadas hacia los marcadores taxonómicos mejor descritos y los organismos europeos, norteamericanos y de Asia oriental. Debido a esto, puede resultar difícil proporcionar una identificación precisa de todos los datos de la escopeta. Además, no siempre es posible obtener muestras de ADNa con suficiente calidad para realizar este análisis de todos los materiales sin una optimización rigurosa, como el material altamente poroso y quebradizo del ladrillo de arcilla utilizado en el presente estudio. La secuenciación de amplicones se centra en fragmentos cortos de genes bien conservados y bien descritos, como los que se encuentran en el operón ribosómico o el cloroplasto y el genoma mitocondrial. Esto puede producir una identificación precisa de las variantes de ADN observadas, pero debido a la estrecha gama de objetivos en comparación con el material genómico total disponible, también puede causar un sesgo hacia los organismos más abundantemente observados. El presente estudio muestra que la secuenciación de amplicones permite proporcionar información sobre los grupos taxonómicos generales de plantas presentes en fragmentos muy pequeños (88–421 mg) de material de ladrillos de arcilla, pero futuros estudios metagenómicos pueden mejorar la identificación de especies individuales a medida que se procesa el ADN del cloroplasto. notoriamente bien conservado entre ciertas familias y géneros de plantas.

Una vez completada la secuenciación del amplicón de las muestras de ADNa, se utilizó el extracto de ADNa restante de las muestras 2 y 5, aquellas con la amplificación e identificaciones más exitosas, para generar un metagenoma de escopeta, utilizando el enfoque de secuenciación de ligadura de ADN genómico de Oxford Nanopore Technologies. Sin embargo, como la cantidad de ADN que ingresaba al protocolo ya era muy baja (≤ 0,1 ng/μL), debido a la pérdida esperada de ADN durante la preparación de la biblioteca, la producción de este fue limitada (aproximadamente 105.000 lecturas de 50 a 300 pb de tamaño). , con calidad suficiente para el análisis). Con base en estos datos limitados, no fue posible determinar los patrones característicos de daño del ADN por desaminación que son exclusivos del ADNa. Sin embargo, fue posible recuperar fragmentos cortos de ADN vegetal, con identificaciones que coincidían con las de los grupos taxonómicos encontrados por los datos de los amplicones. Para futuros análisis, se recomienda optimizar aún más los procedimientos de muestreo y la extracción de ADN para mejorar el rendimiento, lo que a su vez debería permitir la verificación de moléculas de ADN antiguas utilizando software dirigido a ADNa, mediante el uso de análisis de ADN metagenómico. Debido a la naturaleza frágil de la arcilla, se espera que sea necesario aumentar el tamaño de la muestra o al menos la profundidad para lograr un rendimiento de ADN suficiente para un análisis sólido. Sugerimos que los procedimientos de ADN antiguos que investigan huesos, un material igualmente poroso y frágil39, podrían proporcionar información sobre futuras mejoras en la extracción de ADNa.

Con esta investigación hemos descubierto que el ADN antiguo, efectivamente protegido de la contaminación dentro de una masa de arcilla, puede extraerse con éxito de un ladrillo de arcilla de 2.900 años de antigüedad. Detectamos 34 grupos taxonómicos únicos de plantas en nuestras muestras. Hemos demostrado nuestros métodos y alentamos futuras investigaciones sobre este tema, ya que el potencial científico de este enfoque es sustancial para varios campos académicos como la genómica antigua, la asiriología y la arqueología del Cercano Oriente, el clima y la biodiversidad en contextos históricos, y conducirá a una comprensión más profunda de las civilizaciones antiguas y perdidas.

El muestreo inicial del ladrillo de arcilla (número de museo 13854) se realizó el 7 de octubre de 2020, poco después de que se produjera una rotura nueva y no contaminada en el ladrillo de arcilla. De la nueva rotura se extrajeron cuatro muestras. La muestra se llevó a cabo en el almacén del ladrillo del Museo Nacional de Dinamarca. Todas las muestras fueron recolectadas por TPATPA usando una máscara y guantes de látex durante todo el proceso, y los guantes se desinfectaron con etanol al 85% entre cada extracción de muestra. Las primeras cuatro muestras se obtuvieron empleando bisturís estériles para cada muestra, recogiendo o raspando arcilla de la superficie de la rotura. La quinta muestra final consistió en un trozo de arcilla seca del límite entre la rotura nueva y la vieja, que se aflojó durante la manipulación cuando se movía el ladrillo. Las muestras se transfirieron directamente a cinco tubos Eppendorf estériles. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y protegidas de la luz solar hasta que se inició el proceso de extracción de ADN. Las cinco piezas de arcilla pesaban 187, 421, 306, 88 y 272 mg, respectivamente.

Las extracciones de ADN se realizaron en una sala blanca separada del resto de instalaciones del laboratorio molecular, en una planta diferente del edificio, en condiciones estériles. La extracción de ADN en sí se realizó en una mesa de flujo de aire laminar con filtración de aire HEPA que se limpió en profundidad con una solución de lejía al 10 % y se trató con rayos UV durante 1 h antes de comenzar el procedimiento de extracción. Se utilizó un hisopo médico estéril para tomar muestras de todas las superficies del banco y se analizó junto con las muestras de ADNa como control. Ningún personal, excepto la persona que realizó la extracción de ADN, estuvo presente en la sala limpia durante el trabajo, y usó equipo personal de cabeza a rodillas en todo momento. Las muestras sólo se manipularon dentro del banco UV. Todas las superficies, herramientas y artículos de protección personal, como guantes y protectores de mangas, se esterilizaron periódicamente con lejía al 10%, etanol al 70% y RNAseAWAY (Thermo Fisher Scientific).

Todas las muestras se extrajeron mediante una combinación de dos protocolos publicados previamente39,40. Brevemente, las muestras se cubrieron con 1 ml de tampón de lisis (EDTA 0,45 M, pH 8,0, 0,25 mg·mL-1 proteinasa K, N-laurilsarcosilo al 0,5%) y se incubaron durante 1 h a 56 °C con agitación, después de lo cual el sobrenadante Se eliminó y la solución se almacenó a -20 °C durante la noche. Se realizó un segundo paso de lisis con otro 1 ml de tampón de lisis y se incubó durante 1 h a 56 °C, seguido de una noche a 37 °C con agitación. Las muestras se centrifugaron durante 2 minutos a 13.000 xg, se eliminó el sobrenadante y se mezcló con el lisado del primer paso de lisis. Posteriormente, se agregaron 2 ml de Tris-EDTA 10 mM y los lisados ​​se concentraron hasta ~ 200 µl utilizando columnas Amicon Ultra 4 (30 kD). El ADN se aisló, se lavó y se eluyó utilizando columnas MinElute (Qiagen), según las instrucciones del fabricante con cambios menores39,40: Las columnas se secaron durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la elución utilizando 60 µl de tampón EB precalentado a 60 °C. . También se procesó una muestra de extracción de ADN sin plantilla con el mismo procedimiento como control de calidad adicional. La concentración de ADN se estimó utilizando el kit de ensayo Qubit dsDNA High Sensitivity y un fluorómetro Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific).

Los procedimientos de amplificación por PCR se realizaron en un laboratorio donde el trabajo previo y posterior a la PCR están separados, y todos los procedimientos se realizaron en condiciones estériles. La composición de la flora del ADNa en el ladrillo de arcilla se investigó utilizando un código de barras de ADN bien descrito (trnL-gh) para el gen trnL del cloroplasto41 y el gen mitocondrial 12S rRNA42, el último de los cuales se amplificó principalmente como control. Los códigos de barras de ADN trnL-gh y 12SV05 se amplificaron en reacciones de PCR de 25 µL por quintuplicado (1 × PCRBIO Ultra Mix, 400 nM del cebador directo e inverso) con 2 µL de ADN molde, utilizando el siguiente programa de PCR: 95 °C durante 2 min. , 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 50 °C (trnL-gh y 12SV05), 72 °C por 60 s y elongación final a 72 °C por 5 min. Posteriormente se fusionaron reacciones de PCR replicadas. Todos los amplicones generados se purificaron utilizando perlas CleanNGS (CleanNA) con una proporción muestra:perla de 5:4 y se eluyeron en 20 µl de agua libre de nucleasas tratada con UV. La concentración de ADN se estimó utilizando el kit de ensayo Qubit dsDNA High Sensitivity y el tamaño del amplicón se comprobó utilizando D1000 High Sensitivity ScreenTapes en una TapeStation 2200 (Agilent). Además, los extractos de ADN restantes de las muestras 2 y 5 se combinaron y prepararon para la secuenciación metagenómica mediante secuenciación Nanopore, utilizando los mismos protocolos que los amplicones, pero en una celda de flujo separada.

Las muestras se codificaron con barras y se prepararon para la secuenciación de Nanopore de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (PBAC96_9069_v109_revQ_14Aug2019) para la secuenciación de amplicones con códigos de barras de PCR usando un kit de secuenciación de ligadura versión 109 (Oxford Nanopore Technologies), y la secuenciación se realizó usando una celda de flujo R 9.4.1. La secuenciación se realizó durante ~ 16 h.

Los datos de secuenciación sin procesar de los amplicones se llamaron utilizando Guppy v4.2.2 con el modelo R 9.4.1 de alta precisión (HAc) (https://community.nanoporetech.com). La demultiplexación y la eliminación del adaptador se realizaron utilizando Porechop v0.2.3 (https://github.com/rrwick/Porechop), con estrictos requisitos de filtrado de calidad que descartaron todas las lecturas que no tenían ambos códigos de barras con un puntaje de calidad de al menos 85. Los datos demultiplexados se sometieron a un control de calidad adicional a través de NanoPlot v1.3843 y se filtraron por calidad al rango de tamaño esperado (longitud de lectura de 50 a 500 pb) con NanoFilt v2.6.043 con una puntuación q mínima de 10. Luego, las lecturas se alinearon usando minimap2 v2.1744 y pulido usando Racon v1.3.345, y posteriormente agrupados en Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) con una similitud de secuencia del 97% usando VSEARCH v2.13.446. La taxonomía se asignó utilizando BLAST47 en comparación con la base de datos nt (descargada el 3 de agosto de 2022), utilizando criterios mínimos de cobertura mínima de consulta del 60 % y valor e máximo de 10·e-10. Luego se seleccionaron manualmente secuencias representativas de cada organismo identificado con búsquedas explosivas adicionales. La taxonomía se asignó de manera conservadora, generalmente solo al nivel familiar o superior, para limitar el riesgo de identificación falsa positiva a partir de secuencias cortas.

La calidad de los datos obtenidos de la secuenciación metagenómica se verificó y se filtró utilizando los softwares Porechop y NanoPlot, como se describió anteriormente para los datos de amplicones. Se utilizó NanoFilt para seleccionar todas las lecturas con una puntuación Q mínima de 15, pero no se realizaron pasos de filtrado o recorte de tamaño para preservar las lecturas cortas que probablemente eran ADN antiguo del ladrillo de arcilla. Luego, los datos se analizaron utilizando PMDtools v0.60 (https://github.com/pontussk/PMDtools), utilizando dos métodos diferentes para detectar patrones de daño en el ADN. Se utilizó Minimap2 para alinear los datos con un conjunto de genoma de referencia humano (GCF_000001405.40), col silvestre (Brassica oleracea, GCF_000695525.1) y E.coli K-12 (GCF_000005845.2) descargado de refseq en NCBI, como humano, El repollo y las bacterias fueron las fuentes más probables de ADNa presente en las muestras. Los datos se escanearon en busca de daños por desaminación, utilizando –desaminación, y la alineación también se analizó para detectar discrepancias de C a T en los extremos 5 'y 3' de las lecturas metagenómicas.

Todos los datos están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos con el número de acceso al proyecto PRJEB57874.

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Descargar referencias

Los autores agradecen al Museo Nacional de Dinamarca por permitirnos tomar muestras del objeto del museo (número de museo 13854) para nuestra investigación, y agradecemos a los fotógrafos Arnold Mikkelsen y Jens Lauridsen por permitirnos utilizar la fotografía del ladrillo de arcilla para la Fig. 1. La investigación fue financiada generosamente por la Fundación Carlsberg (TPA, SLR), la Fundación para la Conservación del Zoológico de Aalborg (SLR) y la Fundación Edubba (TPA).

Estos autores contribuyeron igualmente: Troels Pank Arbøll y Sophie Lund Rasmussen.

Departamento de Estudios Interculturales y Regionales, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Troels Pank Arbøll

Facultad de Estudios de Asia y Medio Oriente, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Troels Pank Arbøll

Linacre College, Oxford, Reino Unido

Troels Pank Arbøll y Sophie Lund Rasmussen

Unidad de Investigación para la Conservación de la Vida Silvestre, Centro Recanati-Kaplan, Departamento de Biología, Universidad de Oxford, Abingdon, Reino Unido

Sophie Lund Rasmussen

Departamento de Química y Biociencias, Universidad de Aalborg, Aalborg, Dinamarca

Sophie Lund Rasmussen, Nadieh de Jonge, Cino Pertoldi y Jeppe Lund Nielsen

Historia Moderna y Culturas del Mundo, Museo Nacional de Dinamarca, Copenhague, Dinamarca

Anne Haslund-Hansen

Zoológico de Aalborg, Aalborg, Dinamarca

Cino Pertoldi

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Conceptualización: TPA, SLR, AHH, CP, JLN Metodología: TPA, SLR, CP, JLN, NdJ Investigación: TPA, SLR, NdJ, JLN Recursos: TPA, AHH, SLR, JLN Visualización: TPA, SLR, NdJ Análisis formal: NdJ, JLN Adquisición de financiamiento: TPA, SLR Curación de datos: NdJ Validación: NdJ, JLN Administración de proyectos: TPA, SLR, JLN Supervisión: CP, JLN Redacción—borrador original: TPA, SLR, JLN Redacción—revisión y edición: TPA, SLR , JLN, NdJ, AHH, CP

Correspondencia a Troels Pank Arbøll.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Arbøll, TP, Rasmussen, SL, de Jonge, N. et al. Revelando los secretos de un ladrillo de arcilla de 2900 años de antigüedad, descubriendo una cápsula del tiempo de ADN antiguo. Representante científico 13, 13092 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38191-w

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Recibido: 28 de enero de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 22 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38191-w

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