El seguimiento longitudinal de la lesión renal aguda revela la propagación de la lesión a lo largo de la nefrona

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4407 (2023) Citar este artículo

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La lesión renal aguda (IRA) es un factor de riesgo importante para la enfermedad renal crónica (ERC), pero los mecanismos subyacentes de la reparación fallida de los túbulos y la transición IRA-ERC no se comprenden completamente. En este estudio, nuestro objetivo fue realizar un seguimiento dinámico de la lesión y remodelación de los túbulos para comprender si la lesión focal de la IRA puede extenderse con el tiempo. Aquí presentamos un modelo de IRA, en el que solo hicimos isquémica la mitad del riñón. Utilizando microscopía intravital de 2 fotones en serie e identificación genética de células en ciclo, rastreamos la remodelación dinámica del tejido en regiones renales posisquémicas y no isquémicas simultáneamente y durante 3 semanas. El análisis espacial y temporal de las células en ciclo en relación con la muerte celular necrótica inicial demostró una propagación y expansión pronunciadas de la lesión en regiones de tejido no necróticas, lo que predijo la atrofia de los túbulos con expresión epitelial de VCAM1. En resumen, nuestros análisis longitudinales de la lesión, la remodelación y el destino de los túbulos proporcionan información importante sobre la patología de la IRA.

La lesión renal aguda (IRA) se define como una disminución repentina de la función renal, que a menudo es causada por una lesión tubular aguda1. Dependiendo de la gravedad de la agresión, la función renal de los pacientes puede recuperarse. Sin embargo, ya está bien establecido que los pacientes con IRA mantienen un alto riesgo de desarrollar enfermedad renal crónica (ERC) más adelante2,3. Los mecanismos de esta transición IRA-ERC no se comprenden completamente3, pero se asocian con disfunción de las células endoteliales4,5, reclutamiento e inflamación de células inmunitarias intersticiales6,7,8, fibrosis intersticial renal9,10 y reparación epitelial de los túbulos incompleta11,12. El túbulo proximal renal (TP) es el principal sitio de lesión durante la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) y sufre una remodelación significativa13. Tras una lesión, las células PT pueden desdiferenciarse con la expresión de novo de marcadores como Kim-1, Cd44 y vimentina, proliferar y eventualmente volver a diferenciarse en células PT funcionales14,15,16. Sin embargo, en su estado desdiferenciado, también participan en vías de señalización paracrinas que mejoran la inflamación intersticial, el reclutamiento de miofibroblastos y la posterior remodelación fibrótica14,17,18,19. Estudios recientes de secuenciación unicelular obtenidos de riñones IRI sugirieron además que un subconjunto de estas células PT desdiferenciadas sufre un estado de reparación fallida con una mayor señalización inflamatoria8,11. Por último, la muerte celular necrótica inducida por IRA puede implicar directamente una mayor inflamación del tejido y la promoción de lesiones adicionales20,21.

Para prevenir la transición IRA-ERC, necesitamos una mejor comprensión de cómo la lesión tisular y los procesos de remodelación se vinculan con una recuperación exitosa o fallida. Sin embargo, existen datos longitudinales limitados para estudiar esto. Las biopsias de pacientes con IRA no se recolectan de manera rutinaria y demuestran una heterogeneidad considerable con respecto al momento en que se tomaron las biopsias22. Además, los estudios en animales de IRA clásicamente implican la recolección de órganos para su posterior análisis ex vivo. Por lo tanto, los procesos de remodelación altamente dinámicos inducidos por la IRA se reconstruyen a partir de instantáneas individuales adquiridas de diferentes animales y momentos temporales. Esto limita la comprensión de las interacciones dinámicas entre células y su impacto en el destino de las nefronas. De hecho, varias preguntas bastante básicas sobre cómo el tejido renal puede regenerarse a partir de una lesión aún están sin respuesta o se discuten de manera controvertida: ¿Qué células proliferan en respuesta a una lesión tisular? ¿Qué tan grande es la capacidad de recuperación del tejido renal lesionado? ¿Cómo influye la lesión focal adyacente en el tejido renal ileso? ¿Pueden las lesiones extenderse con el tiempo?

En este estudio, combinamos la microscopía intravital de 2 fotones (2PM) con la identificación genética de células cíclicas23 y un modelo de lesión por isquemia-reperfusión parcial (IRI parcial), que fue conceptualizado para estudiar los efectos de las células necróticas en el tejido adyacente ileso. Las imágenes en serie de riñones IRI parciales durante 3 semanas proporcionaron datos pareados de lesión y remodelación de los túbulos y, por primera vez, vincularon la muerte celular necrótica inicial con los sitios locales de proliferación de los túbulos y, finalmente, con el destino de los túbulos. Por lo tanto, nuestros datos identificaron el túbulo proximal temprano como un sitio clave de lesión necrótica y fuente de formación de cilindros granulares, que se asoció con la propagación de la lesión aguas abajo y el desarrollo de atrofia del túbulo.

Para estudiar los efectos de la lesión necrótica focal en el tejido renal ileso en la IRA a lo largo del tiempo, hemos establecido un modelo de lesión por isquemia-reperfusión parcial. A través de la oclusión de solo una rama de la arteria renal izquierda, aproximadamente la mitad del órgano quedó isquémico, mientras que la otra mitad permaneció perfundida (Fig. 1a, d). La reperfusión se concedió a los 21 min. El día 2 después de la cirugía, los ratones con IRI parcial mostraron un aumento significativo de la excreción urinaria de albúmina (relación albúmina/creatinina (ACR), 24357,5 ± 10073,2 vs. 3333,1 ± 786,3 mg/g, media ± SEM, p = 0,001, n = 4 y 3, IRI parcial versus simulado, respectivamente), (Estadísticas extendidas complementarias.a), que posteriormente se recuperaron a niveles simulados (Fig. 1b). La tasa de filtración glomerular (TFG) se midió en ratones despiertos simulados y con IRI parcial mediante la evaluación del aclaramiento de FITC-sinistrin y no reveló diferencias entre los grupos durante 7 semanas (Fig. 1c).

a Dibujo esquemático del modelo IRI parcial. b, c Relación albúmina/creatinina urinaria y tasa de filtración glomerular (TFG) de ratones con IRI simulado y parcial (b: n = 3 y 4 ratones y c: n = 4 y 8 ratones para IRI simulado y parcial, respectivamente); media ± SEM con diagrama de dispersión. Prueba estadística: ANOVA bidireccional de mediciones repetidas, factores: tratamiento y días desde el tratamiento, análisis post-hoc: comparaciones múltiples, corrección de Bonferroni (Estadísticas ampliadas complementarias.b). d Fotografías representativas de microscopio estereoscópico de un riñón de ratón antes y durante la oclusión de la rama de la arteria renal durante 21 minutos y después de la implantación de la ventana de imagen abdominal (AIW) tras la reperfusión. Las regiones isquémicas y perfundidas fueron claramente identificables hasta la reperfusión. La implantación de AIW se realizó en la interfaz entre las regiones isquémicas (IR), no isquémicas (Not-IR) y el área intermedia (Media). Entrada: Bifurcación arterial (V: vena renal, A: arteria renal, K: riñón. La flecha indica bifurcación). e Imágenes in vivo de 2 fotones adquiridas 2 h después del IRI parcial, identificaron regiones IR, Media y No IR. Barra de escala: 50 μm. Observe la marcada reducción de la autofluorescencia azul en las células tubulares de yoduro de propidio (PI)+ (entrada, barra de escala: 30 μm). f Distribución de la lesión necrótica en regiones simuladas y diferentes de lesión de riñones IRI parciales agrupadas por porcentaje de segmentos con umbral indicado de núcleos PI+ (% del total de núcleos/segmento). g Cuantificación volumétrica de núcleos PI+ (% del total de núcleos/segmento), (n = 123, 334 y 263 segmentos de 5, 7 y 6 ratones para Not-IR, Mid e IR, respectivamente, y 360 segmentos de 3 ratones falsos); media ± 95% IC con diagrama de dispersión. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de la prueba bilateral (Estadísticas ampliadas complementarias.c). h Imagen in vivo de 2 fotones adquirida 6 h después de IRI parcial, que muestra acumulación luminal de células PI+. Barra de escala: 50 μm. *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***:p<0,001.

Para el seguimiento longitudinal de la lesión renal y la recuperación (fallida), se implantó una ventana de imágenes abdominales (AIW) por encima del riñón IRI parcial, lo que permite visualizar repetidamente áreas isquémicas (IR) completas y no isquémicas (Not-IR), así como así como las regiones fronterizas intermedias (Medio) (Fig. 1d). Dos horas después de la reperfusión, in vivo 2PM de riñones IRI parciales, permitió la discriminación de las regiones IR, No-IR y Media en función de la distribución espacial distinta de la muerte celular necrótica detectada mediante tinción con yoduro de propidio nuclear (PI). Las células tubulares PI positivas revelaron además una autofluorescencia azul marcadamente reducida (λEx = 750 nm, λEm = 435–485 nm), indicativa de agotamiento de NADH (nicotinamida adenina dinucleótido)24 (Fig. 1e). En las regiones IR, la muerte de células necróticas epiteliales promedió 21,78 ± 1,32% de núcleos PI positivos por núcleo total de segmento (media ± SEM, n = 263 segmentos de 6 ratones), de los cuales el 76,04% de todos los segmentos de túbulos analizados demostraron muerte de células necróticas epiteliales de gravedad variable (Fig. 1f, g). En las regiones medias, se detectó significativamente menos lesión (6,21 ± 0,54% de células necróticas, media ± SEM, n = 334 segmentos de túbulos de 7 ratones, p <0,001, Estadísticas ampliadas suplementarias.d) y el 48,5% de los segmentos no demostraron ninguna lesión. Muerte de células epiteliales necróticas. En las regiones No-IR, el 4,88% de los túbulos investigados demostraron muerte celular necrótica epitelial dispersa de menor extensión, pero la extensión de la necrosis no fue significativamente diferente de cero (0,15 ± 0,07% de células necróticas, media ± SEM, n = 123 segmentos de túbulos de 5 ratones, p = 0,28, Estadísticas ampliadas complementarias.e), (Fig. 1f, g).

A continuación, investigamos la distribución de la muerte de las células necróticas tubulares después de una lesión isquémica a lo largo de la nefrona. Utilizando 2PM, se puede acceder a los túbulos proximales S1 (PT-S1), a los túbulos proximales S2 (PT-S2), así como a los túbulos contorneados distales, a los túbulos conectores y a los segmentos de túbulos del conducto colector25,26, de los cuales los tres últimos se analizaron colectivamente (DCT /CD) en este estudio. NADH y FADH (flavina adenina dinucleótido) desempeñan funciones importantes en la producción de PT ATP y son simultáneamente excitables a 750 nm utilizando 2PM24,27. De acuerdo con datos anteriores25, los distintos patrones de autofluorescencia de PT azul (λEm = 435–485 nm, NADH) y verde (λEm = 500–550 nm, FAD) (Fig. 2a, b) permitieron una subclasificación confiable de segmentos de PT accesibles en PT- S1 y PT-S2. Por lo tanto, los segmentos PT-S2 mostraron una fluorescencia verde y azul significativamente más fuerte en comparación con PT-S1 y DCT/CD, y la relación de emisión de luz verde/azul permitió una distinción significativa de PT-S1, PT-S2 y DCT/CD. respectivamente (Fig. 2b). Además, el seguimiento del bolo durante la inyección iv de dextrano de 4 kDa conjugado con FITC filtrado libremente en 4 ratones demostró tiempos de llegada del bolo notablemente retrasados ​​en los segmentos de túbulos clasificados como PT-S2 en comparación con los clasificados como PT-S1 (Fig. 2c). De los 875 segmentos de túbulos analizados de ratones con IRI parcial, el 8,7% no fueron clasificables debido a una necrosis grave y se excluyeron de la clasificación.

Una imagen in vivo de 2 fotones de un glomérulo de ratón sano (g) y los túbulos circundantes permite una distinción clara entre los túbulos proximales S1 (PT-S1), proximal S2 (PT-S2) y distales de los conductos contorneados/colectores (DCT/CD). ) basado en distintos patrones morfológicos y de autofluorescencia. Barra de escala: 50 μm. b La identidad del segmento de túbulo se puede asignar basándose en la evaluación cuantitativa de la autofluorescencia epitelial tubular verde (λEm = 500–550 nm) y azul (λEm = 435–485 nm) registrada en λEx = 750 nm (n = 152, 190 y 38 segmentos para PT-S1, PT-S2 y DCT/CD, de 4 ratones 24 h después de IRI parcial, respectivamente); diagrama de caja, línea en la mediana, bordes en los percentiles 25 y 75, bigotes del mínimo al máximo, puntos individuales considerados valores atípicos. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de pruebas bilaterales (Estadísticas ampliadas complementarias.f). c Panel superior: imágenes representativas de 2 fotones in vivo adquiridas durante la inyección en bolo de FITC-4kDa-dextrano revelan la llegada de FITC-4kDa-dextrano filtrado primero como túbulos clasificados PT-S1 y luego como PT-S2. Barra de escala: 50 μm. Panel inferior: fluorescencia luminal de FITC-4kDa-dextrano medida en segmentos PT-S1 y PT-S2 a lo largo del tiempo (n = 15 y 14 segmentos de 4 ratones, respectivamente); media ± SEM. d Imagen in vivo de 2 fotones de un riñón IRI parcial (región isquémica) 2 h después de la reperfusión muestra la distribución de núcleos de yoduro de propidio (PI)+ en diferentes segmentos de túbulos. Barra de escala: 50 μm. e Distribución de la lesión necrótica en regiones IR de riñones IRI parciales en diferentes segmentos de nefrona agrupados por porcentaje de segmentos con umbral indicado de núcleos PI+ (% del total de núcleos/segmento). f, g Cuantificación volumétrica de núcleos PI+ (% del total de núcleos/segmento) a lo largo de diferentes segmentos de túbulos en regiones IR (n = 195, 90, 105 segmentos para PT, PT-S1, PT-S2 de 6 ratones y 14 DCT/ CD de 4 ratones, respectivamente); media ± 95% IC con diagrama de dispersión. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de pruebas bilaterales (Estadísticas ampliadas complementarias.g). *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***:p<0,001.

Como era de esperar, los segmentos PT sufrieron más lesiones que los segmentos DCT/CD. En las regiones IR, la muerte celular necrótica en los segmentos PT promedió 20,41 ± 1,49 % de los núcleos PI positivos (n = 195 segmentos de 6 ratones), de los cuales el 72,82 % de todos los segmentos del túbulo proximal mostraron muerte celular necrótica de diversa gravedad. Por el contrario, la muerte celular necrótica en DCT/CD de regiones IR fue en general de baja extensión en comparación con los segmentos PT (2,89 ± 0,75 % de núcleos positivos para PI, n = 14 segmentos de 4 ratones, p < 0,001 frente a PT, Estadísticas ampliadas suplementarias .h) con el 57,14% de todos los segmentos DCT/CD que demuestran muerte de células necróticas dispersas (<10% de núcleos PI+ sobre el total de núcleos). Al distinguir entre los segmentos PT-S1 y PT-S2, observamos un grado significativamente mayor de muerte celular necrótica en los segmentos PT-S1 (26,19 ± 2,45% de núcleos positivos para PI, n = 90 segmentos de túbulos de 6 ratones) que en los segmentos PT-S2. S2 (15,45 ± 1,68% de núcleos PI positivos, n = 105 segmentos de 6 ratones, p <0,001, Estadísticas ampliadas complementarias.i) (Fig. 2e, f). Se obtuvieron resultados similares al analizar las regiones IR y Media colectivamente y al normalizar el recuento de células PI positivas sobre el área transversal total de los túbulos en lugar del recuento nuclear total (Figura 1 complementaria).

La muerte celular necrótica, detectada mediante tinción con PI, sólo se produjo dentro de las primeras horas después de la reperfusión. Dos horas después de la reperfusión, la mayoría de las células PI positivas parecían estar todavía adheridas a la membrana basal. Sin embargo, 6 h después de la reperfusión, observamos un lanzamiento masivo de células necróticas en la luz tubular (Fig. 1h).

Al seguir los túbulos post-isquémicos a lo largo del tiempo utilizando imágenes intravitales 2PM, detectamos distintos cambios morfológicos del epitelio en remodelación junto con patrones y materiales de autofluorescencia reconocibles. Para una clasificación patológica exhaustiva de los eventos observables, realizamos criosecciones seriadas de riñones post-isquémicos fijos (n = 3), de los cuales dos se tiñeron para tinción con hematoxilina-eosina (HE) y ácido periódico de Schiff (PAS), respectivamente. 2PM tomó imágenes de una tercera sección en serie utilizando la misma configuración que en vivo. Utilizando 2 PM de criosecciones, identificamos eventos de remodelación típicos, como se observa con frecuencia in vivo, y luego volvimos a identificar estas regiones de interés en secciones consecutivas teñidas con HE y PAS utilizando microscopía correlativa (Figura complementaria 2). Un patólogo experimentado examinó y clasificó imágenes de microscopía correlacionadas de secciones congeladas, así como imágenes de 2 fotones in vivo de este estudio. Se clasificaron e investigaron más a fondo los siguientes fenómenos: (1) La acumulación luminal de desechos celulares altamente autofluorescentes en los túbulos se identificó como cilindros granulares y necrosis tubular aguda (NTA). (2) Los túbulos dilatados con epitelio aplanado y simplificado se identificaron como lesión tubular aguda (ATI). (3) Los túbulos autofluorescentes brillantes y colapsados ​​de apariencia fragmentada se identificaron como atróficos (Figura complementaria 2).

Para investigar el ciclo de las células epiteliales después de la IRA in vivo y a lo largo del tiempo, realizamos imágenes en serie in vivo de ratones informadores transgénicos CycB1-GFP, que indican células que ingresan a las fases S, G2 y M del ciclo celular a través de la expresión transitoria de GFP23 (Fig. 3a , y figura complementaria 5). Para validar que los ratones CycB1-GFP realmente identificaron células en proliferación mediante la expresión de GFP, inyectamos EdU diariamente durante 4 días mientras realizábamos imágenes in vivo de la expresión de GFP en los riñones. Después de la fijación por perfusión y el etiquetado de EdU ex vivo, realizamos imágenes correlativas y confirmamos que las células que expresan GFP también se identificaron como células que incorporan EdU (Figura complementaria 4). Luego cuantificamos la expresión tubular de GFP en riñones simulados y parciales IRI CycB1-GFP con imágenes en serie. La expresión de GFP en riñones simulados fue generalmente baja durante un período de 3 semanas (Tabla complementaria 1, Fig. 3b y Fig. 5a complementaria). En los riñones con IRI parcial, la cantidad de células epiteliales que expresan GFP aumentó durante la primera semana después de la reperfusión, alcanzó su punto máximo en el día 3 y se asoció con un aplanamiento epitelial distintivo y la pérdida del borde en cepillo de los túbulos, indicativo de ATI (Fig. 3a). En las semanas 2 y 3 después de la reperfusión, la expresión epitelial de GFP en riñones IRI parciales disminuyó a niveles simulados (Tabla complementaria 1, Fig. 3b y Fig. 5a complementaria). A continuación, analizamos la expresión de GFP en las regiones IR, Media y No IR de riñones IRI parciales, respectivamente, y a lo largo del tiempo. Dos horas después de la reperfusión, no hubo diferencias entre los grupos. La expresión de GFP en las áreas IR comenzó a aumentar desde el día 1 y fue significativamente mayor que en las regiones Media y No IR entre los días 1 y 4 después de la reperfusión (Tabla complementaria 1, Fig. 3c y Fig. 5b complementaria). Por el contrario, la expresión de GFP en las regiones medias aumentó solo a partir del día 2 y permaneció elevada hasta el día 7 después de la reperfusión en comparación con las regiones no IR. Siete días después de la reperfusión, la expresión de GFP en las regiones IR y Media fue comparable pero elevada en comparación con las regiones No-IR. En los días 14 y 21 después de la reperfusión, no hubo diferencias entre los grupos (Tabla complementaria 1, figura 3c y figura complementaria 5b). En las regiones fuera del IR, la actividad proliferativa fue en general baja. Sin embargo, en los días 2 y 3 después de la reperfusión, la expresión de GFP aumentó ligeramente y alcanzó niveles significativamente más altos en comparación con la simulación (Tabla complementaria 1, entrada complementaria de la Fig. 5a).

Una microscopía serial de 2 fotones in vivo de una región isquémica en un riñón de ratón indicador parcial IRI CycB1-GFP en los días 0, 1, 2 y 3 después de la reperfusión muestra un aumento de la expresión de GFP (puntas de flecha) con el tiempo. Barra de escala: 100 μm. b – d Cuantificación volumétrica de la expresión de GFP (% del total de núcleos/segmento) en diferentes grupos experimentales (b: IRI simulado y parcial), diferentes regiones de lesión de IRI parcial (c: No-IR, IR y Medio) y diferentes nefronas segmentos ubicados en las regiones IR y Media de los riñones IRI parciales (d: PT-S1, PT-S2 y DCT/CD). Datos de n = 3 ratones simulados y 9 ratones IRI parciales. En la Tabla complementaria 1 (b, c) y en la Tabla complementaria 2 (d) se proporciona información detallada sobre el número de segmentos de túbulos por grupo; diagrama de caja, línea en la mediana, bordes en los percentiles 25 y 75, bigotes del mínimo al máximo, puntos individuales considerados valores atípicos. En la figura complementaria 5 se muestra una descripción general del mismo conjunto de datos, incluida una comparación estadística ampliada. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de pruebas bilaterales (Estadísticas extendidas complementarias.j). #: diferencia significativa dentro del grupo en comparación con el día 0 respectivo; #: p < 0,05; ##:p<0,01; ###:p<0,001. e Imagen representativa de 2 fotones in vivo de la expresión epitelial de GFP en una región IR de un riñón CycB1-GFP 2 días después de la IRI parcial. Barra de escala: 75 μm.

Finalmente, evaluamos la capacidad proliferativa general específica del segmento de túbulos después de IRI parcial. Un día después de la reperfusión, encontramos que los segmentos PT-S1 proliferaron más que los segmentos PT-S2 y DCT/CD respectivamente. Sin embargo, en los días 2 y 3, la expresión epitelial de GFP en los segmentos PT-S2 aumentó drásticamente y superó la de PT-S1 y DCT/CD, respectivamente. No hubo diferencias entre los grupos los días 7, 14 y 21 después de la reperfusión (Tabla complementaria 2, figura 3d y figura complementaria 5c).

Para comprender si la actividad proliferativa epitelial observada derivaba de células vecinas aleatorias de células necróticas o más bien de células progenitoras dispersas, analizamos la distribución espacial de las células en proliferación en relación con las células necróticas detectadas en el día 0. Para ello, trazamos el número de Células tubulares que expresan GFP que emergen en las inmediaciones de una célula necrótica (radio <25 µm), así como el número de células que expresan GFP que emergen fuera de un radio de 25 µm de una célula necrótica determinada dentro de un segmento de túbulo. En promedio, observamos un recuento significativamente mayor de células epiteliales GFP ubicadas en la proximidad inmediata de núcleos PI positivos (2,27 ± 0,15%) en comparación con las detectadas en localización distante (1,62 ± 0,14%, media ± SEM, n = 336 segmentos de 4 ratones para ambos grupos, p <0,001, Estadísticas ampliadas suplementarias.l). Es de destacar que una evaluación más detallada demostró marcadas diferencias entre los tipos de segmentos: en los segmentos PT-S1, las células en ciclo aparecieron casi exclusivamente adyacentes a los sitios necróticos. En los segmentos PT-S2, el ciclo celular comenzó en las proximidades de los sitios necróticos. Sin embargo, dentro de los primeros 3 días, detectamos una población en crecimiento gradual de células que expresan GFP que surgen en una localización distante de cualquier célula necrótica detectada en el día 0. Se obtuvieron dinámicas similares para los segmentos DCT/CD a lo largo del tiempo. Sin embargo, las células GFP que emergen a grandes distancias de los sitios necróticos representaron la mayor parte de la proliferación observada en este grupo (Tabla complementaria 3, figuras 4a-d). Estos datos indicaron que, si bien las células vecinas supervivientes representaban una parte sustancial de las células en proliferación, parecían evidentes mecanismos inductivos adicionales en los segmentos PT-S2 y DCT/CD, respectivamente.

a, b Imágenes seriales de microscopía de 2 fotones in vivo de regiones medias representativas en riñones informadores CycB1-GFP en los días indicados después de IRI parcial. Obsérvese la expresión localizada de GFP (puntas de flecha) alrededor de los sitios necróticos (⊥) en los segmentos PT-S1, mientras que la expresión de GFP surge también en una distancia remota de los sitios necróticos (⊥) en PT-S2. Barra de escala: 50 μm. c Cuantificación volumétrica acumulada de núcleos que expresan GFP (% del total de núcleos/segmento) determinada desde los días 1 a 3 después del IRI parcial para PT-S1, PT-S2 y DCT/CD, que surgieron en proximidad (<25 μm) o localización distante (>25 μm) de cualquier célula de yoduro de propidio (PI)+ detectada el día 0 (n = 145, 184 y 37 segmentos de 4 ratones para PT-S1, PT-S2 y DCT/CD, respectivamente); media ± 95% IC con diagrama de dispersión. Prueba estadística: prueba t pareada bilateral con p < 0,05 considerada significativa (Estadística ampliada complementaria.k). d El mismo conjunto de datos que en (c) se muestra para revelar distintas ubicaciones de células tubulares en proliferación en diferentes segmentos de túbulos durante los días después de la IRI parcial (n = 4 ratones con IRI parcial; información detallada sobre el número de segmento/grupo proporcionada en la Tabla complementaria 3); media ± 95% IC con diagrama de dispersión. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de la prueba bilateral (Estadísticas ampliadas complementarias.m). e Cuantificación volumétrica de la expresión tubular de GFP (% del total de núcleos/segmento) agrupada por umbrales necróticos (n = 223, 140, 157 segmentos PT-S1 y 250, 237, 103 segmentos PT-S2 para pacientes no necróticos, moderados y graves). , respectivamente, de 6 ratones); media ± 95% IC con diagramas de dispersión. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de prueba bilateral (Estadísticas ampliadas complementarias.n). f Regresión lineal de núcleos PI+ (% del total de núcleos/segmento) en el día 0 y núcleos GFP+ acumulados (% del total de núcleos/segmento) de los días 1, 2 y 3 para los segmentos PT-S1 y PT-S2 (n = 144 y 180 de 4 ratones). Para ambos se informa el ajuste (pendiente*x + intersección, representado con IC del 95%), R2 y el coeficiente de Pearson (r). #: diferencia significativa de pendiente e intercepción desde cero. *: prueba de significancia entre grupos, valores de p de la prueba bilateral. */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001.

Para comprender mejor el ciclo celular dependiente de lesiones en los segmentos PT-S1 y PT-S2, analizamos la expresión dinámica de GFP de células no necróticas (0% de muerte celular necrótica en el día 0), moderadamente necróticas (0-20% de células necróticas en el día 0). ) y segmentos de túbulos severamente necróticos (>20% de células necróticas en el día 0). De acuerdo con los hallazgos anteriores, observamos una expresión de GFP significativamente mayor en los segmentos PT-S2 no necróticos y moderadamente necróticos en los días 2 y 3 en comparación con el PT-S1 respectivo (Fig. 4e). Entre los segmentos severamente necróticos, los segmentos PT-S1 proliferaron más que los segmentos PT-S2 el día 1. Sin embargo, la expresión de GFP en los segmentos PT-S2 severamente necróticos aumentó rápidamente desde el día 2 y superó la observada en los segmentos PT-S1 los días 3 y 7. (Figura 4e). Finalmente, nuestro objetivo fue evaluar si PT-S1 y PT-S2 mostraban diferentes capacidades para proliferar tras la muerte celular necrótica de un grado determinado. Por lo tanto, realizamos una regresión lineal de los núcleos positivos para PI (% del total de núcleos) observados el día 0 y el número acumulado de núcleos positivos para GFP (% del total de núcleos) observados en los días 1 a 3 después de IRI parcial. Tanto para los segmentos PT-S1 como para PT-S2, se detectó una correlación significativa entre el número inicial de células necróticas y la respuesta proliferativa posterior (Fig. 4f). Es de destacar que no hubo diferencias significativas en las pendientes de las regresiones lineales, lo que indica una respuesta proliferativa inducida por necrosis comparable en los segmentos PT-S1 y PT-S2 (Fig. 4f). Sin embargo, detectamos una intercepción significativamente mayor en la regresión lineal de los segmentos PT-S2 (Fig. 4f), lo que demostró una población de segmentos PT-S2 que proliferaron en ausencia de lesión necrótica previa. Por el contrario, la intersección de la ecuación de regresión lineal PT-S1 no fue estadísticamente diferente de cero, lo que confirma que la proliferación en estos segmentos dependía estrictamente de la presencia de lesión necrótica inicial.

Para comprender por qué los segmentos PT-S2 proliferaron en ausencia de muerte celular necrótica, registramos de cerca los procesos de remodelación observables en riñones IRI parciales a lo largo del tiempo. La lesión necrótica en PT se asoció con el desprendimiento de células tubulares muertas y material de la membrana apical hacia la luz del túbulo (Figs. 1h, 4a, b). Desde el día 1 después de la reperfusión, observamos una formación granular luminal pronunciada (Fig. 5c), que con el tiempo fluyó aguas abajo a lo largo de la nefrona (Fig. 4b, Película complementaria 1) y eventualmente también apareció en la luz de segmentos de nefrona previamente no necróticos. (Figuras 4b, 5a). Luego cuantificamos el área luminal de los modelos granulares en el plano de la pila z que muestra el diámetro del túbulo más grande y lo normalizamos al área de la sección transversal del segmento de túbulo respectivo a la misma profundidad. La acumulación de cilindros granulares fue detectable en segmentos PT-S2 necróticos (3,81 ± 0,51 %, n = 274 segmentos de 3 ratones) y no necróticos (4,04 ± 0,43 %, n = 269 segmentos de 4 ratones), pero fue insignificante en los respectivos PT- Segmentos S1 (necróticos: 0,14 ± 0,13%, n = 221 segmentos de 4 ratones; no necróticos: 0%, n = 213 segmentos de 4 ratones), (Fig. 5d).

a Imágenes representativas de microscopía de 2 fotones in vivo en serie de una región media en riñones CycB1-GFP en los días 0, 1 y 2 después de IRI parcial. Observe cómo aparecen las células GFP+ (puntas de flecha) 1 día después de la acumulación de moldes granulares (flechas) en segmentos inicialmente no necróticos (PI-negativos en el día 0). Barra de escala: 100 μm. b Fotografía estereoscópica representativa de un riñón de ratón durante la oclusión de la rama de la arteria renal que muestra una región fronteriza típica entre las regiones del riñón perfundido e isquémico. c, d Área del modelo granular luminal medida en el plano transversal más grande de cada segmento tubular y normalizada por el área transversal del segmento respectivo a la misma profundidad de imagen, agrupada por días después de la IRI parcial (c) (n = 468 , 328, 329 y 320 segmentos para los días respectivos de 6 (día 00) y 4 (día 01-03) ratones), y tipo de segmento en ausencia o presencia de necrosis (d), respectivamente (n = 213 y 221 para PT-S1 no necrótico y necrótico de 4 ratones; 269 y 274 segmentos para PT-S2 no necrótico y necrótico de 4 y 3 ratones, respectivamente). Cualquier túbulo con >1% de células necróticas PI+ en el día 0 se clasificó como necrótico; media ± 95% IC con diagramas de dispersión. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de prueba bilateral, sin ajuste para comparaciones múltiples (Estadísticas ampliadas complementarias.o). e Regresión lineal del área del molde granular luminal (% del área de sección transversal total del segmento) y núcleos GFP+ (% del total de núcleos/segmento, evaluados en 3D) medidos 24 h después en el mismo segmento y proliferando fuera de un radio de 25 µm desde cualquier Núcleo PI+ (n = 179 y 184 para segmentos necróticos y no necróticos de 4 y 3 ratones, respectivamente). Ajuste (pendiente*x + intersección, trazado con IC del 95 %); Para ambos se informan R2 y el coeficiente de correlación de Pearson (r). #: diferencia significativa de pendiente e intercepción desde cero. *: diferencia significativa entre los tipos de segmento, valores p de la prueba bilateral, */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001.

Es de destacar que la acumulación de yeso granular en los segmentos PT-S2 coincidió espacialmente con la expresión de GFP un día después y parecía independiente de la lesión necrótica inicial en los segmentos respectivos (Fig. 5a). Para explorar más a fondo una asociación entre la acumulación de cilindros granulares y el ciclo celular en los segmentos PT-S2, trazamos la extensión de los cilindros granulares luminales sobre el porcentaje de células positivas para GFP que emergen fuera de un radio de 25 um de un núcleo necrótico determinado en el mismo túbulo. segmentos 24 h después. El análisis de regresión lineal para segmentos PT-S2 no necróticos demostró una correlación significativa entre el grado de acumulación de molde granular y la expresión de GFP observada un día después (Fig. 5e). Por el contrario, el mismo análisis realizado únicamente en segmentos necróticos PT-S2 dio como resultado una pendiente y un R2 significativamente más bajos, pero una intersección más alta (Fig. 5e). En conjunto, estos análisis longitudinales de eventos de remodelación en riñones IRI parciales indicaron la propagación de la lesión a lo largo del túbulo proximal, según lo determinado por la acumulación de yeso granular en segmentos de túbulos aguas abajo previamente no necróticos, que se correlacionaban con su compromiso posterior de proliferar.

A continuación, probamos la hipótesis de que el retraso en la proliferación en segmentos de túbulos no necróticos que acumulan yeso granular se produjo independientemente de una lesión potencialmente subletal inducida por IRI. Para lograr esto, infligimos una lesión necrótica selectiva en segmentos individuales de PT-S1 para investigar si esto provocaría acumulación y proliferación de moldes granulares en segmentos de PT-S2 posteriores. Por lo tanto, utilizamos el láser de 2 fotones como micromanipulador14,28,29,30,31 para inducir una lesión selectiva y focal en segmentos PT-S1 de riñones CycB1-GFP sanos mediante exposición enfocada al láser. Esto resultó en una captación selectiva de PI en el epitelio PT-S1 dirigido por láser sin lesión necrótica detectable en el intersticio renal circundante o el epitelio tubular (Fig. 6b, c). Luego hicimos un seguimiento de posibles procesos de remodelación a lo largo del tiempo utilizando la serie 2PM. Como se esperaba, la lesión con láser desencadenó una proliferación epitelial pronunciada en los segmentos PT-S1 específicos (Fig. 6b, c). Es de destacar que la lesión focal de PT-S1 inducida por láser también indujo la acumulación de yeso granular en algunos de los segmentos de túbulos de PT-S2 circundantes. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores, observamos significativamente más núcleos GFP+ en los segmentos PT-S2 que acumularon cilindros granulares luminales que en aquellos que no lo hicieron (8,35 ± 1,47 %, n = 39 vs. 0,46 ± 0,07 %, n = 461, p < 0,001, Fig. 6d, Estadísticas ampliadas complementarias.u) y el análisis de regresión lineal demostraron una correlación significativa entre la abundancia de cilindros granulares luminales en segmentos PT-S2 ilesos y la expresión evidente de GFP 24 h después (Fig. 6e). Además, las inyecciones diarias de EdU durante experimentos de lesión con láser seguidas de imágenes correlativas confirmaron la proliferación real de núcleos que expresan GFP como se observa in vivo a través de una clara superposición con los núcleos que incorporan EdU como se visualiza ex vivo (Figura complementaria 4b). Para evaluar la proliferación y la lesión subletal inespecífica infligida por láser en los segmentos de túbulos circundantes, analizamos el número total de núcleos epiteliales GFP+ en diferentes zonas definidas por el aumento de la distancia a la membrana basolateral de los respectivos segmentos PT-S1 dirigidos por láser (Fig. 6f). En caso de que la acumulación de yeso granular y la posterior expresión de GFP en segmentos PT-S2 no específicos se debieran a una lesión láser inespecífica y subletal, el número de núcleos GFP+ debería ser mayor en las inmediaciones del sitio de la lesión. Sin embargo, los túbulos directamente adyacentes a los segmentos PT-S1 lesionados por láser (0–35 µm) no revelaron una expresión epitelial de GFP más elevada en comparación con los túbulos distanciados entre 35–85 y 85–135 µm del segmento PT-S1 lesionado ( Figura 6f). Estos datos sugirieron que los segmentos de túbulos PT-S2 que acumulan yeso granular representaban partes aguas abajo de la misma nefrona que el segmento PT-S1 dirigido por láser y proliferaban independientemente de cualquier lesión láser inespecífica. De acuerdo con esta suposición, los segmentos PT-S2 que proliferaban y acumulaban yeso granular a menudo se ubicaban a una distancia razonable del segmento PT-S1 objetivo del láser (Fig. 6c), mientras que la mayoría de los segmentos de túbulos que rodeaban la lesión no revelaron signos de lesión y/o remodelación celular (Fig. 6b, c). En conjunto, estos datos indican que la lesión selectiva de PT-S1 inducida por láser provoca la acumulación de cilindros granulares en los epitelios de los túbulos sanos aguas abajo, que posteriormente se comprometen a la proliferación.

Imágenes seriales de microscopía de 2 fotones in vivo de regiones renales representativas de CycB1-GFP sin (a) y con lesión focal selectiva de PT-S1 (b, c) mediante exposición dirigida al láser de 2 fotones (línea naranja). b Serie de imágenes representativas antes y después de la lesión focal de PT-S1 inducida por láser en la que no se detectó acumulación de yeso granular en los segmentos de PT-S2 circundantes. Obsérvese la proliferación local (puntas de flecha) en el segmento PT-S1 objetivo sin lesión epitelial inespecífica o proliferación en los segmentos de túbulos circundantes. c Serie de imágenes representativas antes y después de la lesión focal de PT-S1 inducida por láser en la que la acumulación de yeso granular luminal (flechas) y la posterior expresión de GFP (puntas de flecha) fueron detectables en segmentos de PT-S2 circundantes, inicialmente ilesos, de una distancia remota al sitio de la lesión. Barra de escala: 50 μm. d Cuantificación volumétrica de núcleos GFP+ (% del total de núcleos/segmento) en segmentos PT-S2 no granulares con acumulación de yeso (sin moldear) y granulares con acumulación de yeso (enyesados) el día 02 después de la lesión focal de PT-S1 (n = 461 y 39 para segmentos no moldeados y moldeados, de 7 ratones); diagrama de caja, línea en la mediana, bordes en los percentiles 25 y 75, bigotes del mínimo al máximo, puntos considerados valores atípicos. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de la prueba bilateral (Supplementary Extended Statistics.u). e Regresión lineal del área del molde granular luminal (% del área transversal total del segmento) el día 01 y núcleos GFP+ (% del total de núcleos/segmento) medidos 24 h después en segmentos PT-S2 ilesos (n = 498 de 7 ratones) . Ajuste (pendiente*x + intersección, trazado con IC del 95 %); Se informan R2 y el coeficiente de Pearson (r). #: diferencia significativa de pendiente e intercepción desde cero. f El número normalizado de núcleos GFP+ detectados en diferentes zonas definidas por el aumento de la distancia desde la membrana basolateral del segmento PT-S1 lesionado con láser indica que no hay proliferación inespecífica inducida por láser en los túbulos adyacentes a la lesión (0–35 µm). (n = 20 para cada zona de 7 ratones); diagrama de caja, línea en la mediana, bordes en los percentiles 25 y 75, bigotes del mínimo al máximo, puntos individuales considerados valores atípicos). Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de la prueba bilateral (Supplementary Extended Statistics.u). */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001.

Las imágenes longitudinales intravitales 2PM de riñones IRI parciales durante 21 días documentaron lesión epitelial postisquémica y eventos de remodelación posteriores, que conducen a la atrofia de los túbulos o a la recuperación (Fig. 7 y Fig. 6 complementaria). Al analizar la distribución oportuna de la determinación del destino, encontramos que el destino del 77% de todos los túbulos en recuperación y del 55% de todos los túbulos atróficos ya estaba determinado el día 7 después de la reperfusión. Para el día 14, se determinó el destino de un 21% y un 34% adicionales de los túbulos en recuperación y atrofia (Fig. 7g), lo que indica que la mayoría de los procesos de remodelación decisivos tuvieron lugar dentro de las primeras 1 a 2 semanas después de la reperfusión. Para probar si los túbulos recuperados también se regeneraron funcionalmente, medimos la capacidad dinámica de recaptación de albúmina como la proporción de albúmina marcada con fluorescencia en el borde en cepillo del túbulo apical y en la luz de los capilares peritubulares14. El día 0, la capacidad de recaptación de albúmina de los túbulos en recuperación se redujo notablemente en comparación con el IRI parcial ileso y los PT simulados, pero se recuperó a niveles simulados el día 7. Por el contrario, la capacidad de recaptación de albúmina en los túbulos que se volvieron atróficos se mantuvo baja durante todo el período de observación ( Fig. 7a, b, Películas complementarias 2 y 3).

a Imágenes seriales de microscopía de 2 fotones in vivo de regiones medias e IR representativas en riñones CycB1-GFP en los días indicados después del IRI parcial muestran la expresión de GFP (puntas de flecha) en el epitelio tubular aplanado (FL) y cilindros granulares (flechas) en túbulos atróficos (ω ). Barra de escala: 100 µm. b Evaluación dinámica de la recaptación de albúmina PT-S1 a lo largo del tiempo (n = 80, 40, 28 y 22 para segmentos de túbulos simulados, ilesos, recuperados y atróficos de 3 ratones simulados y 4 IRI parciales); media ± 95% IC con diagrama de dispersión. Prueba estadística: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de prueba bilateral (Estadísticas ampliadas complementarias.p). c, d Cuantificación volumétrica de núcleos PI+ (% del total de núcleos/segmento) en el día 0 (de túbulos con >1% PI+) (c) y núcleos GFP+ (% del total de núcleos/segmento) en el día 3/4 (d) , en segmentos de túbulos recuperados y atróficos, respectivamente (c: n = 89 y 92 segmentos de 4 y 3 ratones; d: n = 124 y 168 segmentos de 4 ratones, respectivamente); media ± 95% IC con diagrama de dispersión. Pruebas estadísticas: modelo lineal de efectos mixtos, valores p de prueba bilateral (Estadísticas ampliadas complementarias.q). e Imágenes correlativas de microscopía de 2 fotones in vivo y ex vivo de riñones CycB1-GFP 21 días después de IRI parcial revelan inmunotinción tubular selectiva de VCAM-1 (azul, flechas) en túbulos atróficos (ω). Barra de escala: 100 µm. f, g Distribución del destino tubular (%) en áreas de IRI parciales (f: n = 82,232 y 153 segmentos para No-IR, Medio e IR de 4, 6 y 5 ratones, respectivamente), y días después de IRI parcial (g: n = 103 y 106 para túbulos recuperados y atróficos de 6 ratones, respectivamente). h Regresión binaria del área del molde granular luminal (en % del área transversal total del segmento) en el día 3/4 y destino de los túbulos respectivos (0 = no atrofia; 1 = atrofia), (n = 237 segmentos de 4 ratones, respectivamente ). Ajuste (pendiente*x + intersección); Se informan el R2 y el tamaño del efecto como odds ratio (OR) para el predictor. *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***:p<0,001.

Al analizar la distribución de segmentos de túbulos atróficos, recuperados y no lesionados en las diferentes regiones parciales del IRI, encontramos que la mayoría de los túbulos atróficos (68%) se desarrollaron en la región IR, en la que solo el 15% de los túbulos se recuperaron y el 16% no estaban lesionados. . En las regiones medias, el 14% de los segmentos de túbulos se atrofiaron, el 47% se recuperaron y el 37% resultaron ilesos. Las regiones no IR consistían casi exclusivamente en túbulos ilesos (97%) (Fig. 7f). Entre los segmentos de túbulos necróticos, los túbulos atróficos demostraron significativamente más necrosis en el día 0 en comparación con los túbulos en recuperación (23,78 ± 1,54 %, n = 92 segmentos de 3 ratones frente a 13,29 ± 1,04 %, n = 89 segmentos de 4 ratones, p < 0,001 , Estadísticas ampliadas complementarias.r), (Fig. 7c). Sin embargo, el 30% de todos los túbulos atróficos carecían de muerte celular necrótica el día 0. Curiosamente, estos túbulos generalmente estaban ubicados cerca de segmentos de túbulos fuertemente lesionados y gravemente afectados por la acumulación de yeso granular (Figura 7 complementaria), lo que sugiere una conexión con la muerte celular necrótica. segmentos de túbulos aguas arriba. Como se demostró anteriormente, la acumulación de cilindros granulares también se asoció con la proliferación del epitelio tubular inicialmente no necrótico. Sin embargo, un gran número de células en ciclo no predijo la recuperación de los túbulos. Por el contrario, encontramos una expresión de GFP significativamente mayor (evaluada el día 3/4 después de la reperfusión) en los túbulos que se volvieron atróficos en comparación con los túbulos en recuperación (10,85 ± 0,94% frente a 4,92 ± 0,54%, n = 168 y 124 segmentos de 4 ratones, respectivamente, p = 0,0065, estadísticas ampliadas complementarias). Por lo tanto, a continuación probamos si la acumulación de cilindro granular predijo la atrofia de los túbulos trazando el área del cilindro granular luminal (en % del área transversal total) evaluada en el día 3/4 de un segmento de túbulo y su probabilidad de atrofia (0 = sin atrofia). ; 1 = atrofia) según se determina al final del experimento. El análisis de regresión binaria obtuvo una relación altamente significativa (p <0,001; R2 = 0,81, Fig. 7h). Entre los túbulos con casos graves y con llenado de luz de acumulación de cilindros granulares, el 87% se volvió atrófico, mientras que solo el 13% se recuperó (n = 131 segmentos de 4 ratones), lo que indica que los cilindros granulares predijeron la atrofia tubular de manera dependiente de la dosis. Por el contrario, los túbulos con epitelio aplanado y simplificado (indicativo de ATI en lugar de ATN) se recuperaron en su mayoría (62%) y sólo el 38% se volvieron atróficos (n = 94 segmentos de n = 5 ratones).

Para investigar un posible papel de los túbulos atróficos en la transición IRA-ERC, realizamos inmunohistología ex vivo32 para VCAM-1, un marcador sugerido recientemente de recuperación fallida del túbulo proximal11 (n = 3). Por lo tanto, las imágenes correlativas del mismo tejido renal inmunoteñido que las imágenes previamente in vivo (21 días después de la reperfusión) revelaron positividad epitelial de VCAM-1 selectivamente en túbulos atróficos, mientras que los túbulos recuperados en los mismos riñones permanecieron negativos para VCAM-1 (Fig. 7e).

La microscopía intravital en serie del riñón utilizando la técnica AIW es un enfoque poderoso para estudiar los cambios estructurales y funcionales en el riñón en remodelación a lo largo del tiempo y se basa en observaciones longitudinales14,29,32,33. En este estudio, explotamos 2PM intravitales en serie del riñón de ratón vivo para investigar la lesión epitelial y la recuperación en un modelo de IRA, que fue conceptualizado para comprender los efectos de la lesión focal en el tejido renal ileso. En primer lugar, informamos diferencias significativas en la susceptibilidad de los segmentos de nefrona PT-S1, PT-S2 y DCT/CD hacia la lesión necrótica post-isquémica. En segundo lugar, demostramos que las células epiteliales necróticas son reemplazadas en gran medida por la proliferación de células vecinas supervivientes. En tercer lugar, documentamos cómo la pérdida de células necróticas postisquémicas y la acumulación de desechos celulares luminales (cilindros granulares) perpetúan la lesión renal e inician la remodelación y proliferación epitelial en segmentos de túbulos previamente no necróticos aguas abajo. En cuarto lugar, nuestros datos identifican una lesión necrótica post-isquémica alta y la acumulación de cilindros granulares como fuertes predictores del desarrollo de atrofia tubular y demuestran la expresión de novo de la proteína proinflamatoria y profibrótica VCAM-1 en los túbulos atróficos, lo que sugiere un papel activo de esta población de túbulos en la transición IRA-ERC.

De acuerdo con trabajos previos13,34, nuestro estudio identificó el túbulo proximal como el sitio principal de lesión necrótica post-isquémica. Si bien en general se acepta en el campo que el túbulo recto proximal (PT-S3) sufre el mayor grado de lesión post-isquémica, la mayoría de los datos disponibles no distinguen entre PT-S1 y PT-S234,35, que son funcionalmente considerados iguales y difíciles de separar unos de otros34. Nosotros y otros25,26,36 demostramos que PT-S1 y PT-S2 se pueden distinguir de manera confiable entre sí usando 2PM. A diferencia de las técnicas de investigación tradicionales, nuestro enfoque de imágenes en serie nos permitió superar en gran medida las dificultades de clasificar los segmentos del túbulo proximal lesionados, ya que se consideraron múltiples puntos de tiempo para la clasificación de los segmentos. Nuestros datos demuestran claramente una mayor susceptibilidad a la lesión necrótica en los segmentos PT-S1 post-isquémicos en comparación con PT-S2. Si bien los PT dependen principalmente del metabolismo aeróbico para satisfacer sus necesidades energéticas, la glucólisis anaeróbica puede ser crítica para preservar la viabilidad en situaciones de disponibilidad reducida de oxígeno37. De acuerdo con nuestros hallazgos, la inhibición de la respiración mitocondrial en riñones de rata perfundidos aislados demostró una jerarquía clara de lesión del segmento PT, siendo PT-S1 el más susceptible, seguido de PT-S2 y menos PT-S338. Debido a la penetración insuficiente del láser en el tejido renal25,39, en nuestro estudio no se pudieron investigar los segmentos PT-S3 profundos. El aumento de la necrosis post-isquémica de PT-S1 en comparación con PT-S2 podría explicarse por una menor capacidad de PT-S1 para generar ATP a partir de la glucólisis. De acuerdo con tal hipótesis, estudios previos demostraron una mayor vulnerabilidad de PT-S2 hacia la inhibición del metabolismo de la glucosa que PT-S125,38.

Las imágenes longitudinales y el análisis de la lesión epitelial y la remodelación en ratones reporteros CycB1-GFP demostraron una estrecha relación espacial entre las células necróticas y cíclicas. Dentro de las 24 h posteriores a la lesión necrótica postisquémica, las células supervivientes en las proximidades de los sitios necróticos se comprometen a proliferar. De acuerdo con un mayor grado de lesión necrótica inicial en PT-S1, la proliferación celular en los primeros momentos (24 h después de la IRI parcial) fue mayor en PT-S1. Sin embargo, la actividad proliferativa en los segmentos de nefronas posteriores aumentó drásticamente con el tiempo. Por lo tanto, la correlación de la información espacial y temporal de las mismas células renales durante varios días finalmente reveló que la proliferación en los segmentos PT-S1 estaba restringida principalmente a las células vecinas de los sitios necróticos, mientras que los segmentos PT-S2 y DCT/CD demostraron una población creciente de Células en ciclo a una distancia remota de la lesión necrótica inicial. Sorprendentemente, observamos que este fenómeno se correlacionaba espacial y temporalmente con la acumulación de moldes granulares precedentes en la luz de los respectivos túbulos. Las imágenes consecutivas de los mismos segmentos de túbulos durante varios días demostraron claramente la aparición de cilindros granulares en los sitios de lesión necrótica, que viajaron lentamente aguas abajo hacia segmentos de túbulos previamente no necróticos y coincidieron con la expresión epitelial de GFP en el camino (Fig. 4b). Utilizando un modelo de lesión selectiva adicional de PT-S1, demostramos además que este fenómeno también ocurrió en segmentos de PT-S2 completamente sanos aguas abajo del sitio de la lesión y en ausencia de efectos potencialmente subletales de la isquemia en los túbulos no necróticos. Es de destacar que la proliferación epitelial acelerada no se asoció con una recuperación exitosa (Película complementaria 1). Por el contrario, detectamos un mayor número de células en ciclo en los túbulos, que eventualmente se volvieron atróficos, que en aquellos que se recuperaron. Puede resultar sorprendente la mayor probabilidad de atrofia de los túbulos en presencia de una mayor actividad proliferativa epitelial. Sin embargo, nuestros datos indicaron una relación lineal entre el grado inicial de muerte de las células necróticas tubulares y el número de células tubulares proliferantes que surgen a partir de entonces. Así, el aumento de la actividad proliferativa observado en los túbulos atrofiados también fue precedido por un mayor grado de necrosis epitelial y la formación de cilindros granulares. De acuerdo con esto, la acumulación de cilindros granulares no solo se asoció con una proliferación epitelial progresiva sino que también predijo el desarrollo de atrofia tubular de una manera dependiente de la dosis. En general, estas observaciones indican un papel previamente subestimado de la necrosis temprana del túbulo proximal en la IRA y demuestran evidencia de una propagación sustancial y determinante de la lesión a lo largo de la nefrona. Aunque estos procesos todavía iniciaron programas de reparación epitelial, este último finalmente se consideró infructuoso en presencia de una necrosis epitelial demasiado grave. De acuerdo con el concepto de propagación de lesiones inducidas por necrosis en segmentos de nefrona aguas abajo, datos antiguos de microscopía óptica y electrónica de riñones de rata post-isquémica ilustraron necrosis en túbulos contorneados proximales, mientras que los segmentos de túbulos rectos proximales estaban completamente bloqueados por ampollas luminales acumuladas35. Además, la formación de ampollas en la membrana y la formación de cilindros granulares durante la IRA se han asociado con la obstrucción de los túbulos y el reflujo34,35,40, lo que puede favorecer la atrofia de los túbulos. Por último, la ruptura de la membrana durante la muerte celular necrótica forma desechos celulares y conduce a la extracelularización de los llamados patrones moleculares asociados al peligro (DAMP), que pueden impulsar aún más la inflamación y lesión del tejido, un proceso comúnmente conocido como necroinflamación41.

Es de destacar que también observamos cómo los segmentos PT-S1 moderadamente necróticos se presentaron más tarde sin signos clásicos de ATN (p. ej., formación de cilindros granulares), sino que mostraron un fenotipo de ATI, con epitelio simplificado y adelgazado, que carecía de borde en cepillo (Fig. 4a). días 2–3 y Fig. 7a día 3 Mediados). Dado que las biopsias de pacientes con IRA a menudo muestran características de ATI, el papel de la NTA en la IRA humana es objeto de controversia22,42. Nuestro enfoque longitudinal permitió seguir los mismos túbulos renales a lo largo del tiempo y demostró que la ATI puede estar precedida por una necrosis tubular de leve a moderada. Las biopsias de pacientes con IRA no se obtienen de forma rutinaria, su número es limitado y se toman en momentos heterogéneos después de la lesión22, lo que dificulta excluir el papel de la muerte celular necrótica en la IRA humana. Además, los análisis de orina de pacientes con IRA demostraron cilindros de color marrón turbio con numerosas células epiteliales renales, lo que sugiere ATN43. Estas observaciones indican la necesidad de más material de pacientes para reevaluar el papel de la ATN en la IRA humana.

La reparación fallida de los túbulos puede ser un factor de transición entre IRA y ERC. Utilizando histología correlativa ex vivo, demostramos claramente la expresión tubular de novo de VCAM-1 de forma selectiva en túbulos atróficos. A diferencia de los marcadores comunes de lesión tubular, como Kim1 o NGAL, la expresión de VCAM-1 no ocurre durante la fase de lesión aguda, sino que comienza a aumentar entre los días 3 y 7 después de la reperfusión8,11, que es también cuando se observó por primera vez la atrofia tubular en nuestro conjunto de datos. (Figura 7g). VCAM-1 es un marcador recientemente establecido de un estado proinflamatorio de las células del túbulo proximal que participa en la activación de las células inmunitarias y la señalización profibrótica11. De acuerdo con nuestros hallazgos, un estudio reciente vinculó la expresión renal de VCAM-1 con la atrofia renal progresiva, determinada por la disminución del peso del riñón después de AKI8. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la atrofia tubular puede presentar más que un estado tubular inactivo, pero señalan un papel activo de esta población en la transición IRA-ERC.

En este estudio, mostramos información importante sobre cómo la lesión de los túbulos se vincula con la remodelación y el destino de los túbulos. Nuestros datos demuestran un papel clave de la necrosis temprana del túbulo proximal y la posterior propagación de la lesión en el destino de los túbulos y el desarrollo de la atrofia. En conjunto, estos hallazgos sugieren una posible ventana de intervención terapéutica dentro de los primeros días después de la IRA para limitar la propagación de la lesión y la atrofia de los túbulos.

Todos los procedimientos experimentales con animales en este estudio fueron aprobados por las autoridades locales (Inspección de Experimentos con Animales, Dinamarca, número de permiso: 2020-15-0201-00443) y se informaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE. La línea de ratones indicadores Tg(Pgk1-Ccnb1/EGFP)1Aklo (CycB1-GFP) fue adquirida por The Jackson Laboratory (cepa #:023345) y criada en las instalaciones de barrera para animales del Departamento de Biomedicina de la Universidad de Aarhus. Los compañeros de camada fueron destetados a las 3 semanas de edad. Los ratones adultos se alojaron en el Centro de Investigación Preclínica del Hospital Universitario de Aarhus y en el Centro de Animales del Departamento de Biomedicina de la Universidad de Aarhus. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz: oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a una dieta estándar (#1324, Altromin, Alemania) y agua en 2 a 5 grupos de alojamiento en jaulas ventiladas individualmente (Technoplast modelo GM500 o GM9000) a 21 ± 2 °C y 55 ± 10% de humedad relativa. La ropa de cama consistía en madera de Aspen de 2 a 3 mm de tamaño (ropa de cama midi, Abedd, Letonia) y tubos de algodón comprimido para anidar, y las jaulas domésticas se enriquecieron con Mouse Igloo con ruecas, palitos de madera para masticar, tubos de cartón y Shepherd Shacks. Las jaulas se limpiaron rutinariamente una vez por semana.

Se utilizaron ratones machos y hembras con un peso medio de 26,9 ± 0,8 gy una edad de 17,7 ± 2,3 semanas (media ± SEM) para experimentos in vivo de IRI parcial. El diseño del estudio se resume en la Tabla complementaria 4. La comparación de sexos no se consideró en el diseño del estudio original y los números n no permiten sacar conclusiones finales. Como la IRA es más grave en sujetos masculinos44, recopilamos datos principalmente de sospechosos masculinos (n = 21 hombres y n = 5 mujeres). Los ratones fueron asignados aleatoriamente al siguiente tratamiento: (1) lesión por isquemia-reperfusión parcial (IRI parcial) y (2) cirugías de control simuladas. Para los dos grupos anteriores, se realizaron dos protocolos experimentales en sujetos separados: imágenes intravitales en serie (11 IR parciales, 3 simuladas) y medición de la TFG en ratones que se movían libremente (8 IRI parciales, 4 simuladas). Dentro del grupo de imágenes por infrarrojos parciales, se asignaron n = 6 ratones al protocolo de imágenes en serie a corto plazo (adquisición de imágenes en los días 0, 1, 2, 3 después de la IR parcial) y n = 5 ratones al protocolo de imágenes a largo plazo (adquisición de imágenes en los días 0, 1, 2, 3 después de la IR parcial) adquisición el día 0, 3, 4, 7, 14, 21 después de la IR parcial). Se incluyeron ratones con IRI parcial en el estudio tras la confirmación visual de la restricción temporal y el posterior restablecimiento del flujo sanguíneo en aproximadamente la mitad del tejido renal (como se muestra en las figuras 1a, d). Los ratones con IRI parcial se excluyeron del estudio si la ubicación incorrecta de la ventana de imágenes abdominales no permitía la identificación de las regiones media o IR mediante microscopía intravital.

En nuestro diseño no se pudo realizar el cegamiento del tratamiento experimental ya que la validación del resultado quirúrgico esperado requirió un examen microscópico minucioso durante la cirugía.

Para confirmar la clasificación confiable de PT-S1 y PT-S2, se utilizaron cuatro ratones macho C57/Bl6 de 10 semanas de edad. Para experimentos que aplicaron lesión selectiva de PT-S1 inducida por láser, se utilizaron siete ratones CycB1-GFP macho de 8,7 ± 1,1 semanas (media ± SEM).

Las preparaciones quirúrgicas consistieron en dos procedimientos: inducción de IRA a través de un modelo IRI parcial desarrollado para este estudio e implantación de una ventana de imágenes abdominal (AIW) colocada simultáneamente sobre los lados lesionados y ilesos del riñón (Fig. 1d) para microscopía intravital en serie. . El implante AIW se preparó pegando un cubreobjetos de 12 mm con pegamento de cianoacrilato en la parte superior de un implante formado por dos anillos delgados de titanio (14 mm de diámetro), separados por una ranura de 1,5 mm de ancho32,45,46,47.

Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (3,5% para inducción, 1,5–1,75% para mantenimiento, caudal de 1,2–1,8 l/min, 50% de oxígeno en aire medicinal), recibieron buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, Temgesic) mediante inyección ip y se colocaron sobre una almohadilla térmica de 37 ± 0,5 °C con un termómetro rectal (hB101/2, aparato de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.). El ungüento para los ojos previno la deshidratación de la córnea. El flanco izquierdo del ratón se afeitó y se desinfectó con clorhexidina (0,5% en etanol al 70%), y se realizó una incisión dorsoventral de 1 cm mm en la línea media entre la caja torácica y la rodilla izquierda. El riñón izquierdo se reposicionó suavemente mediante maniobras de tejido conectivo de modo que su superficie ventral quedara ranurada en el centro de la incisión. Después de una cuidadosa disección del tejido conectivo, se expuso la bifurcación arterial en el pedículo (Fig. 1a, d) y se ocluyó la rama de la arteria derecha con un hilo de seda 6-0 durante 21 minutos mientras se mantenían la temperatura y la hidratación del riñón con una esponja Spongostan (Ethicon) lavada continuamente con solución salina a 36,5 °C. Después de la reperfusión, la pared abdominal que rodea el riñón se suturó a la piel mediante una sutura en bolsa de tabaco para la implantación de la ventana de imágenes abdominal (AIW). Utilizando 10 µl de pegamento de cianoacrilato, se pegó el riñón al implante AIW. La colocación cuidadosa de la AIW sobre el riñón aseguró que las áreas de tejido post-isquémicas y no isquémicas fueran accesibles (Fig. 1d). Finalmente, se aseguró la piel alrededor del surco de la AIW apretando la sutura en bolsa de tabaco32,46. Luego, se inyectaron ip 10 µl/g de solución salina estéril BW para suplementación de líquidos. La analgesia posoperatoria consistió en 1 a 3 mg/kg de peso corporal de Meloxicam sc administrado después de la cirugía y dosis iguales de Meloxicam y Temgesic una vez al día durante los 2 días posteriores a la cirugía. Los ratones se recuperaron en una cámara calentada durante 2 h antes de la primera sesión de imágenes.

Para caracterizar el impacto de la IRI parcial en la función renal, medimos la tasa de filtración glomerular (TFG) por vía transcutánea durante 7 semanas en ratones simulados (n = 4) y con IRI parcial (n = 8) que se movían libremente mediante monitorización transcutánea de la TFG (Medibeacon, Alemania). 48. En resumen, los ratones fueron anestesiados con isoflurano (dosis de inducción del 3,5%) y afeitados minuciosamente con crema depilatoria. Luego, se pegó con cinta adhesiva un detector de fluorescencia miniaturizado (Medibeacon, Alemania) a las costillas del animal y se administró un análogo de inulina conjugado con FITC, sinistrina, mediante inyección retroorbitaria (5 mg/100 g de peso corporal; Medibeacon). Se suspendió el isoflurano y se permitió que el ratón se despertara. La medición duró 90 min. La TFG se analizó como la tasa de eliminación de FITC-sinistrin siguiendo el manual de instrucciones utilizando el modelo de 3 compartimentos.

La albuminuria se evaluó como la relación albúmina/creatinina en muestras puntuales de orina49,50 y durante un período de 4 semanas (n = 3 simulados y n = 4 IRI parcial). Después de la recolección, la orina se congeló a -80 °C hasta el análisis. El contenido de albúmina y creatinina en orina se analizó utilizando un kit ELISA de albúmina de ratón disponible comercialmente (Nordic Biosite, Producto N° E99-134) y un kit de detección de creatinina urinaria (Thermo Fisher, Producto N° AIACUN), respectivamente.

Realizamos microscopía intravital en serie durante hasta 3 semanas para rastrear la dinámica de las células epiteliales tubulares individuales a lo largo del tiempo en ratones IRI parciales y simulados. Se realizaron 2PM in vivo utilizando un láser coherente Chamelion Ultra II y una configuración multifotónica Ultima Investigator Plus (Bruker Corporation, Billerica, MA, EE. UU.) con el software PraireView IV en configuración de objetivo vertical (objetivo Olympus XLUMPLFLN 20X, inmersión en agua, 1,00 NA, 2,0 mm de ancho). Las longitudes de onda de excitación utilizadas fueron 750 nm y 940 nm. La señal de emisión se detectó después de un filtro de 720 sp en 3 fotomultiplicadores GaAsP (Hamamatsu, H7422-40) (Ch1: λet = 595/50 nm, Ch2: λet = 525/50 nm, Ch3: λet = 460/50 nm). Además, utilizamos un microscopio vertical de 2 fotones Olympus FVMPE-RS (Olympus, Japón) con el software Fluoview FV31S (Olympus, Japón) que estaba equipado con un láser de excitación MaiTai HP DS-OL (Spectra Physics, Estados Unidos), XLPLN25xWMP2. objetivo, inmersión en agua (Olympus, Japón, NA 1,05; WD 2,00 mm) y los siguientes cubos de detección: Ch1: λet = 610/70 nm (PMT multiálcali), Ch2: λet = 540/40 (GaAsP), Ch3: λet = 480/40 (GaAsP).

Antes de la obtención de imágenes, los ratones se anestesiaron con isoflurano (la misma dosis de inducción de la cirugía) y 10 µl de yoduro de propidio (PI, 0,25 mg/ml, Thermo Fisher) y 1 µl/g de peso corporal de 2,5 mg/ml de albúmina conjugada-Alexa Fluor. Se inyectó retroorbitalmente una solución de colorante 594 (Alexa594-albúmina, Invitrogen). El PI es un colorante cargado que se intercala en el ADN y que penetra específicamente en las células necróticas debido a la alteración de la integridad de la membrana51. Para confirmar la clasificación del segmento PT-S1/PT-S2, se inyectó dextrano de 4 kDa conjugado con FITC en forma de bolo a través de la vena de la cola (10 µl/bolo de solución de 40 mg/ml en PBS).

Para obtener imágenes en serie, el implante AIW se insertó en un marco de imágenes personalizado impreso en 3D que proporciona estabilización de imagen en una configuración de microscopio vertical52. Durante la obtención de imágenes, la anestesia y la temperatura se mantuvieron con un vaporizador de isoflurano de flujo bajo (30 a 50 ml/min, 1,2 a 1,5%) (SomnoSuite, Kent Scientific), que estaba equipado con una manta térmica colocada debajo del animal.

Primero, adquirimos un atlas completo de la superficie del riñón conectado a AIW a una longitud de onda de excitación de 750 nm, lo que permitió la navegación del tejido durante sesiones de imágenes consecutivas. Identificamos áreas de necrosis intensa mediante una combinación de señal PI nuclear específica y una reducción visible de la autofluorescencia epitelial tubular emitida en el espectro azul a una longitud de onda de excitación de 750 nm25. En ratones sometidos a IRI parcial, identificamos tres regiones reproducibles (Fig. 1e): (1) tejido dañado por reperfusión isquémica (regiones IR); (2) regiones fronterizas que rodean el lado isquémico con una cantidad limitada de necrosis (regiones medias); (3) tejido ileso, región No-IR). En ratones simulados, todo el tejido se clasificó como región No-IR.

A continuación, identificamos entre 4 y 8 campos de visión (FOV) sobre el atlas en los tres tipos de regiones. Tomamos imágenes de cada FOV con longitudes de onda de excitación dual en tres canales de emisión (descritos anteriormente) usando la siguiente secuencia de adquisición: (1) excitación de 940 nm, imagen única a 20-30 μm de profundidad desde la cápsula del riñón, definida como la sección del punto medio del FOV ( 1024 × 1024, tiempo de permanencia: 3,2 μs, exploración Galvo Aster); (2) excitación de 940 nm, serie volumétrica de 60 μm de profundidad de rango −30 a +30 μm desde el punto medio del FOV (512 × 512, tiempo de permanencia: 2,4 μs, escaneo de trama Galvo, tamaño de paso de 1 μm); (3) y (4), parámetros idénticos de (1) y (2) después de cambiar la longitud de onda de excitación a 750 nm; (5) retorno motorizado en la sección del punto medio del FOV para evaluar la posible mala colocación de células tubulares individuales durante la adquisición. La intensidad del láser se calibró para ofrecer un rango de potencia láser de 20 a 35 mW en el objetivo. El factor de zoom utilizado osciló entre 1 y 2,5X. La secuencia de adquisición se incorporó como función de PraireView Scripts para minimizar el error del usuario.

Para confirmar la clasificación del segmento PT-S1/PT-S2, se registró un lapso de tiempo de 13,7 Hz durante la inyección en bolo iv de dextrano de 4 kDa conjugado con FITC.

Para la lesión selectiva de los segmentos PT-S1, utilizamos el láser de 2 fotones como micromanipulador14,28,29,30,31 para extirpar selectivamente células definidas en un único segmento PT-S1 dentro de un FOV. Por lo tanto, nos dirigimos específicamente a aproximadamente 35 células tubulares PT-S1 adyacentes a través de escaneos lineales repetidos (tiempo de permanencia de píxeles: 4 µs/píxel) sobre el epitelio tubular seleccionado utilizando excitación de 750 nm. Posteriormente, se tomaron imágenes de los ratones diariamente durante los siguientes 3 días para investigar los procesos de remodelación dentro de los segmentos de túbulos lesionados y circundantes ilesos. Al lado se adquirieron FOV de control a una distancia remota de la lesión por láser. Antes de cada sesión de imágenes, a los ratones se les administró PI y albúmina Alexa594, como se describió anteriormente.

Realizamos análisis de imágenes manuales y recuento de células en escaneos volumétricos utilizando los complementos FIJI53 Bio-Formats y BIOP Multi-Stack-Montage54. Las dos pistas de excitación para cada secuencia de imágenes se fusionaron en una única imagen compuesta (Figura complementaria 3) utilizando BIOP-Multi Stack Montage. La asignación de pseudocolores en imágenes fusionadas se realizó para garantizar una visualización adecuada de las imágenes fusionadas como se describe en detalle en la Figura complementaria 3. La señal en cada canal individual completo se ajustó mediante mejora de contraste (histograma ajustado saturando el 0,35 % de los píxeles de la imagen) para garantizar visualización adecuada de cada canal individual en las imágenes compuestas fusionadas. Se puede acceder a las tablas de búsqueda de visualización completa (LUT) de cada canal de imágenes en el repositorio de imágenes asociado con este trabajo (https://doi.org/10.5061/dryad.vq83bk3z8).

La evaluación cuantitativa de las señales de intensidad fluorescente se realizó en imágenes no procesadas. De cada exploración volumétrica incluida en este estudio, extrajimos la siguiente información cuantitativa para cada segmento tubular epitelial individual (número de segmentos para cada día de registro y grupo resumidos en la Tabla complementaria 4): (1) Identidad del segmento (túbulo proximal (PT) S1 y S2, y los túbulos de los conductos contorneados/colectores distales (DCT/CD), que clasificamos en función de las diferencias morfológicas y las intensidades brutas de la autofluorescencia de FAD y NADH y su relación (Fig. 2a-c). De los 875 segmentos de túbulos analizados de forma parcial Ratones IRI, 8,7% fueron inclasificables. (2) Área tubular transversal máxima (μm2). (3) Número de núcleos totales/segmento. (4) Número de núcleos PI+ y (5) Número de células que expresan GFP por segmento. Los números de núcleos totales, PI+ y GFP+ se evaluaron en 3D: el recuento de núcleos se realizó de forma volumétrica utilizando el recuento de 5 planos en un volumen de 25 µm que cubría de arriba a abajo cada segmento analizado. Los núcleos tubulares se excluyeron del citosólico azul intenso. la autofluorescencia de los túbulos se registró con una excitación de 750 nm y, por lo tanto, fueron claramente identificables como objetos teñidos negativamente en células de túbulos individuales (Figura complementaria 3). La cuantificación del número de núcleos de PI+ se realizó en función de su fuerte emisión de rojo nuclear en células necróticas en datos de seguimiento de 750 nm (Figura complementaria 3). La cuantificación de GFP se realizó en base a datos de la pista de excitación de 940 nm, que es óptima para la excitación de GFP55 y permitió una separación clara de la señal de GFP de la autofluorescencia del epitelio tubular y de la señal de emisión granular, respectivamente (Figura complementaria 3). Para el recuento de GFP, se creó un subgrupo específico para las células que proliferaban dentro de un radio de ~25 µm desde cualquier célula necrótica en el día 0. (6) La cantidad de cilindros granulares (desechos celulares) en la luz del túbulo se evaluó como el área de contenido luminal sólido. sobre el área de la sección transversal en el plano del diámetro mayor del túbulo. (7) Clasificación morfológica del estado de remodelación tubular: epitelio simplificado aplanado (lesión tubular aguda), cilindros granulares (necrosis tubular aguda) y túbulo atrófico se realizó para cada día desde la cirugía en el conjunto de datos a largo plazo; (8) La clasificación del destino del segmento tubular como simulado, ileso, recuperado o atrófico se basó en la evaluación de la morfología al final del experimento (día 14 o día 21 del conjunto de datos a largo plazo). Sham incluía segmentos tubulares de controles simulados. Los segmentos no necróticos se definieron como PI negativos en el día 0, que permanecieron funcional y morfológicamente conservados a lo largo del tiempo. Los segmentos recuperados se definieron como PI+ el día 0 (>1% del total de núcleos) que recuperaron el epitelio morfológicamente intacto. Los segmentos atróficos se definieron por una luz tubular colapsada y una apariencia epitelial severamente fragmentada (Figura complementaria 2). (9) La función dinámica de PT-S1 se evaluó como la capacidad de recaptación de albúmina expresada como la relación de intensidad fluorescente media de la albúmina Alexa594 en la región citoplásmica apical de los segmentos de PT-S1 y en los capilares peritubulares (n = 170).

En los casos de reidentificación fallida de FOV individuales durante cualquier momento de adquisición, faltaban datos seriados de los respectivos puntos de tiempo y no se podían incluir en análisis posteriores. Los datos mostrados indican n números para los segmentos de túbulos analizados y los ratones experimentales, respectivamente.

Para confirmar la clasificación del segmento PT-S1/PT-S2, se analizaron registros de lapso de tiempo de seguimiento de bolos de dextrano de 4 kDa conjugado con FITC inyectado por vía intravenosa colocando regiones luminales de interés (ROI) en PT-S1 y PT-S predeterminados. Segmentos S2. La intensidad fluorescente de FITC en el espectro de luz verde (λem = 525/50 nm) se extrajo de las regiones de interés y se representó gráficamente a lo largo del tiempo.

Los datos sin procesar se recopilaron y ensamblaron en Microsoft Excel v. 2305 para realizar análisis estadísticos adicionales, como se describe a continuación.

El procesamiento de imágenes se realizó utilizando la “Caja de herramientas de procesamiento de microscopía intravital para FIJI”52 publicada recientemente utilizando las siguientes características:

La eliminación de ruido de las pilas se realizó con la transformación estabilizadora de varianza (VST)56 BM4D34 en MATLAB v. 2022a (Mathworks). Primero, se estimó la desviación estándar del ruido (sigma) en 5 imágenes separadas con el algoritmo de Liu et al.57 alrededor del medio y el último cuadro de la pila total y luego se promedió hasta un solo valor. En segundo lugar, se aplicó a los datos un Anscombe VST56 generalizado. Después de aplicar el VST, la pila se dividió en 10 fragmentos de fotogramas superpuestos por 5 fotogramas en cada extremo y luego se procesó en paralelo con el filtro de eliminación de ruido BM4D. Finalmente, los fragmentos procesados ​​con BM4D se ensamblaron en una sola pila y se aplicó un Anscombe VST [36] inverso de forma cerrada para obtener la pila final sin ruido.

Se registraron pilas de imágenes para mejorar la visualización de los planos focales correspondientes en presencia de una remodelación tisular más grave inducida por isquemia con el uso del complemento FIJI BigWarp y una transformación de rotación rígida58. La pila del día 0 de cada FOV se estableció como imagen objetivo para usar como referencia, los puntos de referencia se colocaron manualmente en los datos de seguimiento de las estructuras correspondientes. La operación se repitió hasta que se consideró que la alineación era visualmente exitosa.

Después del último experimento, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y fijados con perfusión con PFA al 4% para la recolección de tejido y la posterior inmunohistología.

Los riñones se fijaron posteriormente en PFA al 4% durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se procesaron para inclusión de tejido congelado o microscopía correlativa ex vivo. Para la incrustación de tejido congelado, los riñones se colocaron en sacarosa al 30 %/PBS hasta que se hundieron hasta el fondo, se congelaron en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura, EE. UU.) y finalmente se almacenaron a -80 °C. Para la microscopía correlativa ex vivo, los riñones se procesaron inmediatamente siguiendo el protocolo de tinción que se describe a continuación.

Microscopía correlativa de secciones de riñón congeladas sin teñir, teñidas con HE y PAS: se cortaron en serie secciones congeladas de 6 µm de espesor de tejido post-isquémico (n = 3 riñones) y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE), ácido periódico de Schiff. (PAS) o dejarlo sin teñir. Se tomaron imágenes de secciones teñidas con HE y PAS en un microscopio óptico Leica, y de secciones congeladas sin teñir se tomaron imágenes en un microscopio de 2 fotones Olympus FVMPE-RS usando excitación de 750 nm y los siguientes cubos de detección: Ch1: λet = 570/30 nm, Ch2: λet = 503/35 nm, Ch3: λet = 452,5/22,5 nm. Los mismos segmentos de túbulos se localizaron en secciones teñidas con HE, PAS y sin teñir, respectivamente, para comparar cómo se detectaron distintos eventos de remodelación a través de 2PM mostrados en tejido teñido con HE y PAS, respectivamente. Un patólogo experimentado revisó la serie de imágenes y clasificó diferentes eventos de remodelación como se describe en la Figura complementaria 2.

Microscopía correlativa ex vivo de tejido renal inmunoteñido con VCAM-1: el área renal cortical, que estaba unida a la AIW, se separó como una sección de tejido de 1 a 2 mm de espesor. El tejido recuperado se lavó dos veces en PBS durante 15 minutos, seguido del bloqueo en BSA al 1%/SEA BLOCK al 2%/Triton X-100 al 0,1%/PBS durante 1 h. Se incubó anticuerpo primario de conejo anti-VCAM-1 (Abcam AB0134047, 1:200) 12 durante 72 h a 4 °C. Posteriormente, se incubó el anticuerpo secundario Donkey anti-Rabbit Alexa 405 (Jackson ImmunoResearch 711-175-152, 1:500) durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBS, la sección de tejido se incrustó en PBS entre dos cubreobjetos separados por un espaciador de 1 a 2 mm de espesor (SunJim Lab) y se tomaron imágenes en un microscopio de 2 fotones Olympus FVMPE-RS. Las mismas regiones de tejido fotografiadas in vivo se identificaron basándose en puntos de referencia del tejido, como formas de túbulos reconocibles y patrones de fluorescencia32. Las imágenes se adquirieron a una longitud de onda de excitación de 800 nm y la emisión se recopiló utilizando los siguientes cubos de detección: Ch1: λet = 570/30 nm, Ch2: λet = 503/35 nm, Ch3: λet = 452,5/22,5 nm. Validación de anticuerpos: el fabricante validó la especificidad de conejo anti-VCAM-1 (Abcam AB0134047) para inmunohistología en tejido de ratón utilizando validación knockout y tejido de bazo de ratón como control positivo. La idoneidad del anti-VCAM-1 de conejo para identificar células con reparación tubular fallida se estableció previamente para tejido de ratón y humano11,12. La tinción inespecífica de Donkey anti-Rabbit Alexa 405 (Jackson ImmunoResearch 711-175-152) se excluyó realizando el mismo protocolo de tinción sin incubación de anticuerpos primarios.

Para confirmar la expresión selectiva de GFP en células en proliferación, inyectamos diariamente 1 μl/g BW de EdU (1 mg/ml en PBS estéril, Invitrogen C10424) ip en 3 ratones CycB1-GFP durante 4 días. Se utilizó la serie diaria 2-PM para registrar la expresión de GFP a lo largo del tiempo. El cuarto día, los ratones se fijaron con perfusión y los riñones se fijaron posteriormente como se describe anteriormente. La visualización de EdU inyectada in vivo en tejido fijado se realizó utilizando un kit de ensayo de citometría de ensayo Click-iT Edu Flow Alexa fluor 647 (Invitrogen, C10424). Las muestras se lavaron dos veces durante 15 min en PBS a 300 rpm, 20 °C en un Thermomixer Eppendorf, seguido de permeabilización en PBS con Triton X-100 al 0,5 % durante 15 min a 300 rpm, 20 °C. Posteriormente, las muestras se incubaron en un cóctel de reacción EdU modificado, donde se añadió Triton x-100 al 1% al PBS durante 6 h a 20 °C, 300 rpm. Después de la tinción, la muestra se lavó dos veces durante 5 minutos en PBS a 20 °C, 300 rpm y se almacenó en PBS a 4 °C hasta la obtención de imágenes. Para correlacionar la expresión de GFP determinada in vivo con la incorporación de EdU visualizada ex vivo, realizamos imágenes correlativas de los mismos FOV que se muestran in vivo en un microscopio confocal Zeiss LSM710 (Zeiss, Alemania).

Utilizamos MATLAB v. 2022a para análisis estadísticos (The Mathworks Inc.). Para los datos de imágenes, los segmentos tubulares individuales se consideraron unidades estadísticas y cada análisis consistió en una medición repetida del mismo túbulo a lo largo del tiempo. Para manejar los puntos de datos faltantes y el número heterogéneo de muestras en diferentes ratones, construimos modelos lineales de efectos mixtos para cada conjunto de datos derivados de análisis de segmentos. Las variables de respuesta y los efectos fijos se especifican en la sección "Análisis estadísticos ampliados" en Información complementaria para cada análisis. Los resultados de los análisis de regresión lineal se presentan como: ecuación lineal (y = pendiente*x + intersección), bondad de ajuste R2 y tamaño del efecto estimado como coeficiente de correlación de Pearson. Los predictores y grupos se especifican en la leyenda de cada figura. Las ecuaciones lineales se presentan en los respectivos diagramas de dispersión para subrayar las comparaciones estadísticas entre pendientes e intersecciones como efecto de un predictor determinado. Se utilizaron sujetos animales individuales como efectos aleatorios para todos los modelos lineales de efectos mixtos. La TFG y las proporciones de albúmina/creatinina se analizaron con un ANOVA de dos factores emparejado en Graph Pad Prism (el mismo tiempo del sujeto emparejado en diferentes días) con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Las cifras cuantitativas y las estadísticas relacionadas se realizaron utilizando la caja de herramientas Gramm59. Los datos se informan con media con IC del 95 % en cifras y media ± SEM en el texto, a menos que se indique lo contrario. Los valores p se informan de la siguiente manera: */#: p < 0,05; **/##: p < 0,01; ***/###: p < 0,001. La información detallada sobre las estadísticas de prueba se incluye en la sección "Análisis estadísticos ampliados" de Información complementaria, denominada en el texto "Estadísticas ampliadas complementarias", que comprende: Para ANOVA y modelos de efectos mixtos, valores F con grados de libertad (F (DFn, DFd)). Para las diferencias entre grupos (en pruebas t y comparaciones de estimaciones de grupos post hoc individuales a partir de modelos lineales mixtos), la estimación del modelo de la diferencia entre los grupos (Δ) con intervalos de confianza del 95% inferior/superior (IC del 95% [LL, UL]) y valores t con grados de libertad (t (df)).

Los experimentos de imágenes intravitales de ratones experimentales individuales se realizaron como experimentos independientes. Tras asegurarse de que se dieron los criterios de inclusión (cirugía IRI parcial exitosa y colocación correcta del implante de ventana de imágenes abdominales), se pudieron identificar de manera reproducible diferentes regiones IRI parciales (No-IR, Media e IR) en función de distintos patrones de daño de células necróticas el día 00. Los fenómenos biológicos descritos en este estudio fueron reproducibles en todos los experimentos intentados.

El análisis de la relación albúmina-creatinina de las muestras de orina se realizó por duplicado. Las mediciones transcutáneas iniciales de la TFG se realizaron por duplicado. Después de la cirugía IRI/simulada, las medidas transcutáneas de TFG se realizaron longitudinalmente y, por lo tanto, se obtuvieron como valores únicos por punto temporal y animal.

Se seleccionaron imágenes representativas de 2 fotones in vivo en serie a partir de los datos obtenidos del siguiente número de experimentos independientes: IRI parcial: día 0 = 8 ratones, día 1–2 = 4 ratones, día 3 = 8 ratones, día 4 = 4 ratones, día 7, 21 = 5 ratones; día 14 = 4 ratones; y simulación: día 0, 1, 2, 3, 4, 7, 14 = 3 ratones, día 21 = 2 ratones. Se seleccionaron imágenes correlativas representativas in vivo y ex vivo para la clasificación de procesos de remodelación a partir de datos obtenidos de tres experimentos independientes. Se seleccionaron imágenes correlativas representativas in vivo y ex vivo para la detección de positividad para VCAM1 en túbulos atróficos a partir de datos obtenidos de tres experimentos independientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar utilizados para generar todas las cifras que se muestran en este documento se proporcionan como un archivo de datos fuente. Los datos de imágenes de dos fotones generados en este estudio se depositaron en la base de datos DataDryad: https://doi.org/10.5061/dryad.vq83bk3z8. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Todos los códigos de análisis utilizados para los análisis estadísticos y la generación de gráficos en MATLAB están disponibles en el repositorio de Zenodo: https://zenodo.org/record/7892132.

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Agradecemos a la profesora asociada Rikke Nielsen por la fructífera y crítica discusión de los datos. Además, nos gustaría agradecer al Centro de Neurociencia Funcionalmente Integrativa y al centro de bioimagen de salud de la Universidad de Aarhus por el uso de equipos de imágenes y soporte técnico. IMS ha recibido subvenciones de la Fundación Novo Nordisk (NNF, número de subvención: NNF19OC0054899) y la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus (AUFF, número de subvención: AUFF-E-201 9-7-21). LB recibió el apoyo del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el mando de Marie Skłodowska-Curie (número de subvención: 801133).

Estos autores contribuyeron igualmente: Luca Bordoni, Anders M. Kristensen.

Departamento de Biomedicina, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Luca Bordoni, Anders M. Kristensen, Donato Sardella, Hanne Kidmose, Layla Pohl e Ina Maria Schiessl

GliaLab y Centro Letten, División de Anatomía, Departamento de Medicina Molecular, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Oslo, Oslo, Noruega

Luca Bordoni

Departamento de Patología, Hospital Universitario de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Søren Rasmus Palmelund Krag

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LB desarrolló el modelo de enfermedad y diseñó experimentos de imágenes, adquirió datos de imágenes in vivo, analizó imágenes, seleccionó el conjunto de datos, realizó análisis estadísticos, interpretó los datos y escribió el manuscrito. AMK adquirió datos de imágenes in vivo e in vitro, diseñó experimentos de TFG y adquirió datos de TFG, analizó imágenes, interpretó los datos y escribió el manuscrito. DS desarrolló la configuración personalizada para imágenes in vivo, herramientas de análisis de imágenes y el protocolo de procesamiento de imágenes. HK procesó muestras ex vivo, adquirió datos de TFG, realizó inmunohistoquímica y manejo de colonias de ratones y de laboratorio. LP: analizó imágenes e interpretó los datos. SRPK: Interpretación de datos. IMS conceptualizó el estudio, lo supervisó, financió el trabajo, interpretó los datos y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Ina María Schiessl.

Los autores declaran los siguientes intereses en competencia: se recibieron subvenciones de la Fundación Novo Nordisk (IMS), la Fundación Augustinus (IMS), la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus (IMS) y el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 (LB) de la Unión Europea. Los demás autores no declaran tener otros intereses en conflicto.

Nature Communications agradece a Andreas Linkermann y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Bordoni, L., Kristensen, AM, Sardella, D. et al. El seguimiento longitudinal de la lesión renal aguda revela la propagación de la lesión a lo largo de la nefrona. Nat Comuna 14, 4407 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40037-y

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Recibido: 17 de enero de 2023

Aceptado: 10 de julio de 2023

Publicado: 21 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40037-y

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