Un esquema altamente eficiente para la preparación de bibliotecas desde un solo

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13913 (2023) Citar este artículo

389 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

Aunque los métodos para secuenciar la preparación de bibliotecas a partir de ADN bicatenario están bien establecidos, los de ADN monocatenario (ssDNA) no se han estudiado bien. Además, los métodos existentes tienen limitaciones en cuanto a eficiencia y rendimiento. Por lo tanto, desarrollamos un procedimiento altamente eficiente para secuenciar la preparación de bibliotecas a partir de ssDNA. En este método, el primer etiquetado del adaptador de ssDNA se realiza mediante la ligadura de ssDNA (TACS) mediada por conector de adenilato asistida por desoxirribonucleotidil transferasa terminal (TdT), que informamos recientemente. Después de la síntesis de la cadena complementaria utilizando el ADNss etiquetado con el adaptador, se realiza el segundo etiquetado del adaptador mediante la ligadura del adaptador basada en la topoisomerasa I del virus Vaccinia (VTopoI o TOPO). Con pasos adicionales para la degradación, represión y eliminación del dímero adaptador, el esquema TACS-TOPO propuesto realiza la preparación de una biblioteca de secuenciación sin dímero adaptador a partir de muestras de ssDNA de 24 pg. El esquema TACS-TOPO se aplicó con éxito al análisis de ADN libre de células con preparación de biblioteca sin amplificación a partir de 50 µL de suero humano. También se aplicó un esquema TACS-TOPO modificado al ADN extraído de huesos humanos antiguos, lo que generó de dos a ocho veces más rendimientos de biblioteca que aquellos que utilizan un protocolo de preparación de biblioteca convencional. También se describen los procedimientos para preparar VTopoI y su complejo con un adaptador de oligonucleótido de doble cadena. En general, el esquema TACS-TOPO propuesto puede facilitar el análisis de secuenciación práctico y sensible del ssDNA.

Aunque hay muchos métodos eficaces disponibles para la preparación de bibliotecas de secuenciación a partir de ADN bicatenario (ADNbc)1,2,3, se informan métodos limitados para ADN monocatenario (ADNcc). Hasta la fecha, solo se han establecido tres principios principales para la preparación de bibliotecas de secuenciación a partir de ssDNA. El primer enfoque implica la cola homopolimérica mediada por desoxirribonucleotidil transferasa (TdT) terminal hasta el extremo 3' del ssDNA; Luego, la cola se utiliza como sitio de cebado para convertir el ADNss objetivo en ADNds, seguido del segundo adaptador etiquetado con ADN ligasa T44. La preparación de bibliotecas mediada por TdT es muy eficiente y algunos fabricantes proporcionan kits de preparación de bibliotecas basados ​​en este principio. Sin embargo, una cola larga puede constituir un obstáculo para el análisis de secuenciación posterior.

El segundo método se basa en la ligación del ssDNA catalizada por la RNA ligasa, que une un adaptador 5'-fosforilado al extremo 3' del ssDNA. Por ejemplo, el grupo de Meyer estableció un método basado en CircLigase II5,6. Después de la ligadura del adaptador, el ADNss se convierte en ADNds, seguido del etiquetado del segundo adaptador mediante la ADN ligasa T4. Aunque la ARN ligasa puede conectar dos moléculas de ADN ss, la eficiencia de la reacción está limitada a menos de un pequeño porcentaje. Por lo tanto, el rendimiento de la preparación de bibliotecas utilizando ARN ligasa es bastante limitado.

El tercer enfoque utiliza ADN ligasa T4 para la ligación de ADN ss7. En este método se utiliza un adaptador bicatenario con un hexámero aleatorio monocatenario en un extremo. Si el hexámero aleatorio se hibrida de manera compatible con el extremo del ADNss objetivo, la mella en el extremo parcialmente bicatenario del adaptador se puede sellar con ADN ligasa T4. Este procedimiento basado en ligadura entablillada se llama ssDNA2.0 y muestra una eficiencia superior al método basado en CircLigase II7. Aunque los métodos basados ​​en ARN ligasa y ADN ligasa T4 pueden producir conexiones limpias con el ADN ss objetivo, aún no se han abordado sus bajas eficiencias en la preparación de bibliotecas.

Para mejorar la preparación de la biblioteca de secuencias a partir de ssDNA, desarrollamos una técnica para el etiquetado adaptador eficiente de ssDNA, denominada ligadura de ADN monocatenario (ss) (TACS) mediada por conector de adenilato asistida por desoxirribonucleotidil transferasa terminal (TdT)8. En la ligadura TACS, el ADNss objetivo primero se une con algunos adenilatos utilizando TdT en un proceso llamado ribotailing, seguido de un etiquetado con adaptador mediado por ARN ligasa del ADNss con ribotail. La ribotailing del extremo 3′ del ssDNA le permite comportarse como ARN, lo que mejora en gran medida la eficiencia de ligadura del ssDNA de las ARN ligasas. En consecuencia, la ligadura TACS permite el etiquetado del adaptador de más del 80% del extremo 3' del ssDNA8 objetivo. En particular, la reacción de cola de TdT con ribonucleótido se autoinhibe después de extender de 1 a 3 nucleótidos9, lo que resulta en una interrupción mínima del análisis de secuenciación posterior.

La ligadura TACS se ha aplicado recientemente al análisis de ssDNA corto en la fracción libre de células de la sangre humana10. Después del etiquetado con adaptador de ADN libre de células (cfDNA) mediante ligadura TACS, el ADNss objetivo se convirtió en ADNds, seguido de un etiquetado con adaptador adicional utilizando ADN ligasa T4 (esquema TACS-T4). El rendimiento del esquema TACS-T4 es varias veces mayor que el de los métodos basados ​​en CircLibase II y T4 ADN ligasa10.

Aunque el esquema TACS-T4 mostró mejores rendimientos de la biblioteca, el protocolo tiene algunos problemas prácticos, incluido un etiquetado de segundo adaptador ineficiente y una formación de dímero de adaptador no despreciable10. Aunque la eficiencia de la segunda ligadura podría mejorarse mediante la optimización de la reacción, esto podría aumentar simultáneamente la formación de dímero adaptador. La formación de dímero adaptador podría evitarse si el adaptador que no ha reaccionado se retira antes del segundo paso de ligadura. Sin embargo, un paso de purificación adicional resultaría inevitablemente en la pérdida de ADN preciado. Además, la eliminación completa del adaptador que no ha reaccionado es muy difícil, especialmente cuando la diferencia de tamaño entre el adaptador y el producto es pequeña. Por lo tanto, nuestro objetivo fue establecer un método alternativo con una formación de dímeros reducida y un etiquetado de segundo adaptador mejorado.

Con este fin, consideramos si el etiquetado adaptador basado en topoisomerasa I (VTopoI) del virus vaccinia funcionaría mejor que la ADN ligasa T4 porque la ligadura basada en VTopoI tiene una direccionalidad diferente a la de la ligación con ADN ligasa T4: la mayoría de las ligasas de ADN/ARN conectan los extremo 5′-fosforilado al terminal 3′-hidroxilo del ADN objetivo, mientras que VTopoI activa el extremo 3′-fosforilado para conectar el extremo 5′-hidroxilo del ADN objetivo. Debido a esta diferencia en la especificidad del sustrato, VTopoI nunca pudo conectar su ADN sustrato al adaptador 5′-fosforilado sin reaccionar utilizado en el primer paso de etiquetado del adaptador con ligadura TACS.

El gen que codifica VTopoI fue identificado por primera vez por Stewart Shuman en 198711. Desde entonces, él y sus colegas han estudiado exhaustivamente sus propiedades enzimáticas12,13,14,15,16,17,18,19,20. VTopoI fue reportado como una herramienta para la clonación molecular en 199421; Posteriormente, esta tecnología fue comercializada por Invitrogen (actualmente Thermo Fisher Scientific). VTopoI se ha utilizado como enzima eficaz para clonar fragmentos de ADN en vectores en la denominada tecnología de clonación TOPO. Una vez activado por VTopoI, el vector puede conectarse al ADN objetivo y la ligadura se produce de forma rápida, eficiente y específica. Basándose en estas propiedades, la clonación TOPO se ha considerado una buena opción para iniciar la clonación molecular. Aunque las características de VTopoI en ligadura parecen atractivas para el desarrollo de nuevas tecnologías, estudios limitados han examinado el uso de VTopoI como enzima para ligadura22.

En el presente estudio, investigamos el uso de VTopoI para preparar bibliotecas para la secuenciación de próxima generación a partir de ADN ss corto combinado con ligadura TACS. Describimos métodos para la purificación de VTopoI, la formación del complejo VTopoI-oligonucleótidos (ODN) (VOC), la purificación de VOC y su aplicación para la preparación de bibliotecas de secuenciación a partir de ssDNA (esquema TACS-TOPO).

El gen que codifica VTopoI (GenBank: L13447.1) fue sintetizado por Eurofins Genomics Inc (Tokio, Japón), con optimización de codones para Escherichia coli K-12, exclusión de sitios internos BamHI y EcoRI, y su inclusión en los extremos 5' y Extremos 3′ del ADN, respectivamente (Secuencias Suplementarias). El fragmento BamHI-EcoRI del gen se subclonó en el sitio BamHI-EcoRI de pColdTF, pColdI y pET28a. Para producir la polinucleótido quinasa T4 (T4 PNK), utilizamos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el gen pseT del fago T4 a partir del ADN genómico (ADN T4 GT7, Nippon Gene, Tokio, Japón) con sitios BamHI y EcoRI en el extremo 5'. y 3', respectivamente (Secuencias Suplementarias), y lo clonaron en el sitio BamHI-EcoRI de pColdI. Estas construcciones se introdujeron en T7Express (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se cultivaron en medio caldo Luria-Bertani (LB) (triptona al 1% (p/v), extracto de levadura al 0,5% (p/v) y extracto de levadura al 0,5% (p/v). p/v) cloruro de sodio) con 100 µg/ml de carbenicilina (para pColdTF y pColdI vector, Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) o 50 µg/ml de kanamicina (para pET28a, Fujifilm Wako Chemicals, Tokio, Japón).

Cultivo de células bacterianas. Las células bacterianas transformadas con uno de los vectores de expresión se inocularon en 3 ml de medio LB con antibióticos y se cultivaron durante la noche a 37 °C con agitación vigorosa. El cultivo de semilla se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 2 L con deflectores, que contenía 1 L de medio LB con antibióticos y se cultivó adicionalmente a 37 °C durante 4 h con agitación. Para pColdI y pColdTF, el matraz se enfrió en agua helada durante 30 minutos y se indujo la expresión de proteínas agregando 238 mg de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Para pET28a, la expresión de proteínas se indujo añadiendo 238 mg de IPTG. Los matraces se incubaron a 16 °C durante la noche (pColdI y pColdTF) o 37 °C durante 4 h (pET28a) con agitación vigorosa. Las células se recogieron mediante centrifugación a 2500 xg durante 15 minutos y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Purificación en columna de proteínas recombinantes. Las células bacterianas se disolvieron en 20 ml de tampón HisTrap A (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5, NaCl 800 mM, imidazol 20 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM y glicerol al 10%) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque) y se rompieron. por sonicación. El lisado se aclaró mediante centrifugación a 15.000 xg durante 15 minutos y filtración a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm. La purificación cromatográfica de primera ronda se realizó utilizando una columna HisTrap HP de 5 ml (Cytiva, Marlborough, MA) con tampón HisTrap A y tampón HisTrap B (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,5, NaCl 800 mM, imidazol 200 mM, DTT 1 mM, y 10% glicerol). Luego, la fracción que contenía la proteína diana se diluyó diez veces con tampón de heparina A (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM) y se sometió a una purificación adicional utilizando una columna HiTrap Heparin HP de 5 ml (Cytiva) con tampón de heparina A y tampón de heparina. B (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 1 M). Luego se recogió la fracción de proteína objetivo y se intercambió el tampón con un tampón madre (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM) utilizando la columna de desalinización HiPrep 26/10. Estas purificaciones cromatográficas se realizaron en el sistema de inicio AKTA (Cytiva). Utilizamos los programas de plantilla predeterminados de afinidad, intercambio iónico y desalación para los procesos HisTrap, HiTrap Heparin y HiPrep Desalting, respectivamente.

Finalización y almacenamiento de las proteínas purificadas. Finalmente, la proteína se concentró mediante ultrafiltración utilizando un dispositivo Amicon Ultra-4 30 K (Millipore). La concentración de VTopoI se ajustó a 200 µM y se almacenó a 4 °C hasta su uso. La concentración molar de VTopoI se determinó midiendo la absorbancia óptica a 280 nm y calculando el coeficiente de absorción molar utilizando el banco de trabajo principal CLC (Qiagen, Hilden, Alemania). Para T4 PNK, la concentración de proteína se ajustó a 2 mg/ml (método de Bradford estandarizado con albúmina sérica bovina), y luego la solución se complementó con equivolumen de glicerol y se almacenó a -20 °C. Las actividades de las proteínas VTopoI purificadas se analizaron como se describe en los Métodos complementarios.

Los ODN utilizados en este estudio se resumen en la Tabla complementaria S1. Una reacción de 1 ml que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, cloruro de sodio 160 mM, adaptador TOPO F 10 µM, adaptador TOPO R 10 µM (ya sea TA o romo) y adaptador TOPO-Ext 10 µM. Se preparó en un tubo de ensayo de 1,5 ml. La mezcla de reacción se incubó a 95 °C durante 3 min, seguido de 55 °C durante 5 min y se mantuvo a 37 °C. Luego, 1 ml de la mezcla de oligo, 1 ml de tampón de activación Topo 5 × (Tris-acetato 100 mM, pH 8,0, acetato de potasio 250 mM y acetato de magnesio 50 mM), 100 µl de trifosfato de adenosina (ATP) 100 mM, y se añadieron 100 µl de 1 mg/ml de T4 PNK a un tubo de centrífuga de 15 ml y el volumen total se ajustó a 5 ml con agua. Después de la incubación a 37 °C durante 60 min, la mezcla de reacción se enfrió a 30 °C y se añadieron 250 µl de VTopoI 200 µM. La reacción se incubó a 30 °C durante 30 min.

Luego, la mezcla de reacción se cargó en una columna HiTrap Heparin HP de 1 ml y se separó usando tampones de heparina A y B como se describe anteriormente. Las fracciones se analizaron utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS) y electroforesis en gel de agarosa. Para SDS-PAGE, las muestras se procesaron en un gel Mini-PROTEAN Any kD (BioRad Laboratories) y el gel se tiñó con Bullet CBB Stain One (Nacalai Tesque). Para la electroforesis en gel de agarosa, se tomaron 10 µL de cada fracción, se suplementaron con 1 µL de solución de SDS al 10% y se cargó 1 µL de la mezcla en el gel E-Gel Ex (2%). Aparecieron dos picos principales en la columna de heparina y la fracción que contenía el complejo VTopoI-ODN eluyó antes que el VTopoI sin reaccionar. La fracción que contiene el complejo VTopoI-ODN se recogió y se ajustó a una concentración de ADN de 150 ng/μl medida usando el kit Qubit dsDNA HS. Si era necesario, la solución se concentró con un dispositivo Amicon Ultra-4 30 K y se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Todos los sueros y plasmas humanos utilizados en el estudio actual se adquirieron de fuentes comerciales y se resumen en la Tabla complementaria S2. El procedimiento que se describe a continuación representa la preparación de cfDNA a partir de 100 µL de suero humano. Sin embargo, el volumen de suero o plasma utilizado difirió según el propósito experimental (el volumen de suero/plasma inicial se indica en cada dato). En tales casos, se mantuvieron las proporciones de mezcla de los reactivos.

A un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf), 100 µL de suero humano, 400 µL de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, 5 µL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 500 mM, 1,5 µL de NaCl 5 M, 10 µL de Se añadieron SDS al 10% (p/v) y 10 µl de 20 mg/ml de proteinasa K (Qiagen) y se incubaron a 50 °C durante 1 h. Después de la digestión con proteasa, las extracciones se realizaron dos veces con TE fenol saturado (Nippon Gene) y una vez con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) (Nacalai Tesque). Luego, la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo, suplementado con 50 µL de acetato de sodio 3 M, pH 5,4, y 1100 µL de isopropanol. La mezcla se centrifugó a 15.000 xg durante 5 min y el sobrenadante se descartó por decantación. Luego, el sedimento de ADN se enjuagó con etanol al 70% (v/v) y se disolvió en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.

La preparación de la biblioteca a partir de cfDNA usando el esquema TACS-T4 se realizó como se describió anteriormente10 con algunas modificaciones: repetimos la eliminación del dímero-adaptador basada en inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) solo dos veces, mientras que esta eliminación se repitió cinco veces en el estudio anterior. .

Ligadura TACS. Se mezcló una solución que contenía el ADN ss objetivo con 2,5 µl de tampón TACS 10 × [ácido 2-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)etanosulfónico (HEPES)-KOH 500 mM, pH 7,5, MgCl2 50 mM. 5% (v/v) Triton X-100] y 1 µL de fosfatasa alcalina de camarón (rSAP) (New England Biolabs, Ipswich, MA); Luego se ajustó el volumen total a 11 µL con ddH2O. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 15 min y 95 °C durante 5 min. A continuación, se añaden 10 µl de polietilenglicol (PEG) 6000 al 50 % (p/v), 1 µl de cada uno de ATP 10 mM, adaptador de 25 µM para la versión. X (X representa el número de versión del protocolo 1 a 5, consulte la Tabla complementaria S1), se agregaron 1 µL de 15 U/μL de TdT (Takara Bio Inc, Shiga Japón) y 1 µL de ARN ligasa TS2126 de 2 mg/ml. La ARN ligasa TS2126 se preparó como se describió anteriormente10. Tenga en cuenta que la ARN ligasa TS2126 se puede sustituir por la ligasa de ADN ss CircLigase II de Lucigen (Middleton, WI). La reacción se incubó a 37 °C durante 15 min, 65 °C durante 30 min y 95 °C durante 5 min.

Replicación de ssDNA etiquetado con adaptador. La solución de ADNss etiquetada con el adaptador se mezcló con 14 µL de ddH2O, 5 µL de tampón ExTaq 10 × (Takara Bio), 4 µL de dNTP 2,5 mM, 1 µL de cebador replicante 50 µM (Tabla complementaria S1) y 1 µL de 5 unidades/μL de arranque en caliente GeneTaq (Nippon Gene) seguido de incubación a 95 °C durante 3 min, 45 °C durante 5 min, 55 °C durante 5 min y 65 °C durante 5 min.

Etiquetado de segundo adaptador mediado por COV. Después de la síntesis de la cadena complementaria, se agregaron 5 µL de EDTA 500 mM (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) y 1 µL de 150 mg/mL de VOC (tipo TA) a la mezcla de reacción y se incubaron a 25 °C durante 15 min.

Purificación de la biblioteca. Después del etiquetado del segundo adaptador, la mezcla de reacción se complementó con 35 µl de tampón B2 (clorhidrato de guanidina 3 M, Tween 20 al 20%) y 5 µl de proteinasa K (Qiagen) y se incubó a 50 °C durante 15 min. Luego, se mezclaron 2 µL de perlas magnéticas de carboxilato Sera-Mag (Cytiva, Marlborough, MA) y 100 µL de isopropanol. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, las partículas magnéticas se recogieron en un soporte magnético y se eliminó el sobrenadante. Las perlas se lavaron dos veces con 200 µl de una solución que contenía PEG400 al 32 % (v/v), NaCl 1 M y Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Finalmente, las perlas se enjuagaron con etanol al 70 % (v/v) y el ADN purificado se eluyó con 25 µl de Tris-acetato 10 mM, pH 8,0.

Tratamiento con uracilo ADN glicosilasa (UDG) y endonucleasa 1 apurínica/apirimidínica (APE 1), relleno de mella y amplificación por PCR. A la biblioteca purificada, 5 µL de tampón ExTaq 10 ×, 4 µL de dNTP de 2,5 mM, 1 µL de Amplificación Univ de 20 µM (Tabla complementaria S1), 1 µL de Índice de amplificación X de 20 µM (X se refiere a uno de los índices , consulte la Tabla complementaria S1), se agregaron 1 µL de UDG (New England Biolabs) y 1 µL de APE 1 (New England Biolabs). UDG y APE 1 se utilizaron sólo con TACS-TOPO ver. 4 protocolo (ver sección “Resultados”). Después de ajustar el volumen de reacción a 50 µL con agua, la reacción se incubó a 37 °C durante 15 min (si se incluían UDG y APE 1), 72 °C durante 5 min y 95 °C durante 1 min, seguido de ciclos. de incubaciones de 3 pasos a 95 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min. El número de ciclos utilizados se indica en los datos presentados. Cuando fue necesario, la mezcla de reacción se purificó con 90 µL de AxyPrep MAG PCR clean (Corning, Corning, NY) según las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se eluyó en 21 µl de Tris-acetato 10 mM, pH 8,0.

El ADN humano antiguo utilizado en el estudio actual se extrajo como se describió anteriormente23. Se utilizaron huesos del sitio de la cueva de Inome24 y del sitio de Shimekake25. Los ADN antiguos utilizados en el estudio actual se resumen en la Tabla complementaria S3. Debido a que las concentraciones del ADN antiguo purificado eran débiles y difíciles de estimar, realizamos preparaciones de bibliotecas de secuenciación sin medir las concentraciones.

Las preparaciones de la biblioteca de secuenciación basadas en los métodos convencionales dirigidos al ADNds se realizaron utilizando el kit ThruPlex DNA Seq (Takara Bio Inc.) o el kit KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Ciudad del Cabo, Sudáfrica).

Kit de secuenciación de ADN ThruPlex. A partir de una cantidad indicada de ADN, se realizó el pulido de los extremos y la ligadura del adaptador siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, se preparó una mezcla de PCR de 50 µL siguiendo el manual proporcionado por el fabricante. La reacción se incubó a 72 °C durante 3 min, 84 °C durante 2 min y 98 °C durante 2 min, seguido de cuatro ciclos de incubaciones de tres pasos a 98 °C durante 20 s, 67 °C durante 20 s. y 72 °C durante 40 s, y ocho ciclos de incubación en dos pasos a 98 °C durante 20 s y 72 °C durante 50 s. La mezcla de reacción se complementó con 50 µl de AxyPrep MAG PCR y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, las perlas magnéticas se enjuagaron con etanol al 70 % (v/v) y el ADN purificado se eluyó en 25 µl de Tris-acetato 10 mM, pH 8,0. La biblioteca purificada se almacenó a -20 °C hasta su uso.

Kit de preparación Kapa Hyper. Una solución de 50 µL que contenía ADN de muestra se complementó con 7 µL de reparación final y tampón de cola A y 3 µL de enzima reparación final y cola A, se incubaron secuencialmente a 20 °C durante 30 min y 65 °C durante 30 min. La reacción se complementó con 5 µl de adaptador universal Kapa 300 nM, 30 µl de tampón de ligación, 5 µl de agua y 10 µl de ADN ligasa y se incubó a 20 °C durante 15 minutos. Luego, la reacción se complementó con 88 µL de perlas AMPure XP (Beckman) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Las perlas se recogieron en un soporte magnético para eliminar el sobrenadante, se enjuagaron dos veces con etanol al 80 % (v/v) y el ADN purificado se eluyó con 20 µl de Tris-acetato 10 mM, pH 8,0. Se configuró una reacción de PCR mezclando 20 µl de ADN purificado, 25 µl de KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix (2X) y 5 µl de mezcla de cebadores de mezclas de cebadores KAPA UDI, y se realizó un ciclo térmico con las siguientes condiciones: incubación previa a la PCR a 98 °C durante 45 s; ciclos indicados de incubaciones de tres pasos a 98 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; y una incubación post-PCR a 72 °C durante 1 min.

La concentración molar de la biblioteca de secuenciación se determinó utilizando el kit de cuantificación de la biblioteca de Takara Bio Inc. La secuenciación a pequeña escala se realizó con MiSeq utilizando el nano kit MiSeq Reagent Kit v2 (300 ciclos) en el modo de extremo emparejado con 2 × 151 ciclos. . Para la secuenciación a gran escala, Macrogen Japan Corp. (Tokio, Japón) realizó el modo de extremo emparejado con 2 × 151 ciclos utilizando HiSeq X Ten.

Análisis de ADNc. Las lecturas de cfDNA se analizaron como se describió anteriormente10. El ADN protegido por nucleosomas (NPD) se definió como fragmentos de ADN de 147 a 190 nt de longitud. Por el contrario, el ADN 3S (monocatenario corto) (C3D) libre de células se definió como fragmentos de 35 a 75 nt.

Muestras antiguas. Las lecturas se preprocesaron primero usando fastp26 para recortar y fusionar lecturas de extremos emparejados en una sola secuencia. Luego, las lecturas fusionadas se mapearon en el genoma humano de referencia utilizando la herramienta Burrows-Wheeler Alignment (BWA) con la opción 'mem'27. Finalmente, los archivos de alineación/mapa de secuencia (SAM) exportados se analizaron utilizando mapDamage28,29. Los detalles de los parámetros de análisis se proporcionan en los Métodos complementarios.

Sintetizamos artificialmente VTopoI y lo subclonamos en tres vectores de expresión. Utilizamos pColdTF, pColdI y pET28a para la expresión bacteriana de VTopoI e indujimos con éxito la expresión de proteínas (Figura complementaria S1A). Luego se realizaron purificaciones de resina de níquel utilizando la columna HisTrap HP (Figura complementaria S1A). El eluido de la columna de níquel se fraccionó aún más utilizando resina de heparina (Figura complementaria S1B, C). Después de la purificación, se estimó que las purezas de las proteínas eran superiores al 95% para todos los sistemas de vectores utilizados (Figura complementaria S1D). Se analizaron las actividades de la proteína purificada para determinar la relajación del plásmido superenrollado11. Todas las proteínas recombinantes purificadas mostraron actividad (Figura complementaria S1E). Así, purificamos con éxito las proteínas VTopoI activas. Dado que el rendimiento de proteína obtenido usando el sistema pET28a fue bajo, utilizamos VTopoI producido con pColdI y pColdTF para un mayor desarrollo.

VTopoI reconoce específicamente la secuencia de pentanucleótidos 5′-(C/T)CCTT-3′ en el sustrato dsDNA y escinde el extremo 3′ de la secuencia para formar un enlace covalente con el grupo 3′-fosfato13,21. Esta escisión de una sola hebra conduce a la liberación del superenrollamiento. Después de la relajación del sustrato del ADN, se produce la reacción inversa para volver a unir la cadena escindida. En el caso de que el ADN sustrato tenga una muesca o un espacio en la posición opuesta del sitio de escisión, el ADN aguas abajo de la secuencia de reconocimiento se libera del complejo intermedio para formar un complejo VTopoI-ADN activado (Fig. 1A, reacción 1). . Si se dispone de una molécula de ADN con un extremo compatible, VTopoI ejecuta la reacción inversa para ligarse con la molécula de ADN21. Esta reacción es rápida y eficiente y forma la base de la ligadura basada en Topo.

Formación y purificación del complejo VTopoI-oligonucleótido (VOC). (A) Esquema de formación de complejos. La formación de COV es una reacción de equilibrio. La fosforilación del ADN liberado aumenta efectivamente la cantidad de complejo formado. (B,C) Un ejemplo de formación de COV. Se muestran los efectos de T4 PNK y las composiciones de tampón sobre la formación de complejos. Se muestran imágenes de gel de SDS-PAGE (B) y electroforesis en gel de agarosa con E-Gel Ex (C). Se usó VTopoI expresado con pColdTF para la formación de COV. La proteína VTopoI esperada expresada con el vector pColdTF es 91,0 kDa. (D) Purificación del COV con cromatografía en columna de heparina. Se muestran los análisis SDS-PAGE (arriba) y cromatograma (abajo) de las fracciones. Las líneas azul y roja en el cromatograma indican la absorbancia a 280 nm y el contenido de la solución B, respectivamente. Los números en la imagen del gel y el cromatograma indican los números de las fracciones. El COV se eluye antes que el VTopoI. Las imágenes de gel originales para B, C y D se proporcionan en la Figura complementaria S5.

Como la reacción entre el ADN sustrato que contiene 5′-(C/T)CCTT-3′ y VTopoI es bidireccional, la relación entre el complejo VTopoI-ADN y el VTopoI libre se define por las concentraciones de estas moléculas (Fig. 1A). , reacción 1). Por lo tanto, la prevención de la reacción inversa aumentaría efectivamente la formación del intermedio covalente de VTopoI y ADN (Fig. 1A, reacción 2). Para lograr esto, la fosforilación del ADN liberado es útil porque el ADN liberado no puede volver a unirse después de la 5′-fosforilación (Fig. 1A, reacción 2). Como se esperaba, la formación del intermedio covalente de VTopoI con ODN (VOC) mejoró cuando la reacción se complementó con T4 PNK y ATP (Fig. 1A-C). Los componentes de la solución también afectan la cantidad de COV formado. Por razones desconocidas, el ion acetato fue más eficaz para la formación de complejos que el ion cloruro (Fig. 1B, C). También encontramos que VTopoI producido a partir de la construcción pColdI tiende a precipitar durante la formación de COV (no se muestra); por lo tanto, utilizamos VTopoI basado en pColdTF para un mayor desarrollo. Con base en estas y otras investigaciones, seleccionamos una de las condiciones eficientes para la formación de COV (consulte la sección "Materiales y métodos").

Después de la formación de VOC, la solución todavía contiene ODN, VTopoI y T4 PNK sin reaccionar, que deben eliminarse para evitar reacciones secundarias en las operaciones posteriores. Descubrimos que la cromatografía de afinidad con heparina también fue eficaz para este propósito (Fig. 1D). Los ODN que no han reaccionado tienen carga negativa y no pueden unirse a la resina de heparina cargada negativamente. El VOC puede unirse a la columna de heparina a través de VTopoI, pero se eluye en concentraciones de sal más bajas que el VTopoI y el T4 PNK que no reaccionaron (Fig. 1D). Por lo tanto, la separación de COV de otros materiales que no han reaccionado se puede lograr mediante una única operación cromatográfica con una columna de heparina. Después de la separación, los COV se pueden concentrar fácilmente mediante ultrafiltración. El COV purificado mostró una actividad de ligación razonablemente alta con un ADNbc modelo (ver más abajo); esta actividad podría mantenerse durante más de unos meses con almacenamiento a 4 °C.

A continuación, investigamos la especificidad y eficiencia del etiquetado del adaptador mediante ligadura mediada por COV. Preparamos ODN bicatenarios (sustratos TOPO) como sustratos modelo para este experimento. Los sustratos TOPO se diseñaron para aceptar la ligadura mediada por VOC en un extremo (extremo reactivo), mientras que el otro extremo se bloqueó con 5′-FAM y 3′-fosforilación (extremo inactivo) (Fig. 2A). Se prepararon extremos romos y protuberantes en 3' con A, C, G o T en el extremo reactivo para ver la rigurosidad de la ligadura (Fig. 2A). Además, para investigar la especificidad de los VOC para los estados de fosforilación del extremo 5', preparamos extremos 5'-hidroxilo y 5'-fosforilados para el extremo reactivo (Fig. 2A). Se prepararon tipos de ligadura TA y de extremo romo para el VOC (Fig. 2A).

Especificidades de sustrato del complejo VTopoI-oligonucleótido (VOC). (A) Estructuras de COV (izquierda) y sustratos TOPO (derecha). (B) Imágenes de electroforesis en gel después de mezclar los sustratos VOC y TOPO. Se investigaron los tipos de COV romos (derecha) y TA (izquierda) para determinar su reactividad con sustratos con o sin 5'-fosfato y protuberancias de una base. Si se produce la ligadura, la banda se desplaza hacia arriba. Los símbolos indican lo siguiente: o, extremo hidroxilo; p, extremo fosforilado; Un nucleótido terminal A, C, G o T unido al extremo 5' del sustrato. Para obtener detalles experimentales, consulte Métodos complementarios. Las imágenes de gel originales para B se proporcionan en la Figura complementaria S6.

Investigamos las eficiencias de ligadura de todas las combinaciones de sustratos TOPO y COV (Fig. 2B). Ambos VOC, es decir, los tipos romos y TA, mostraron una fuerte actividad de ligación con el sustrato TOPO de los extremos compatibles. La reacción estuvo casi completa en 15 minutos cuando se suministraron suficientes VOC (Fig. 2B y Métodos complementarios). Aunque los COV mostraron una fuerte actividad en el extremo 5'-hidroxilo, nunca conectaron el adaptador al extremo 5'-fosforilado (Fig. 2B). La ligadura del adaptador al sustrato TOPO del extremo compatible parecía eficiente, mientras que los pares de bases no eran tan estrictos como la fosforilación del extremo 5'; el VOC tipo TA estuvo activo con las protuberancias T, C y G, mientras que el tipo romo reaccionó con todas las protuberancias (Fig. 2B). Aunque la rigurosidad de la ligadura se puede mejorar añadiendo cloruro de sodio30, se logró una mayor rigurosidad con el riesgo de una pérdida grave de la eficiencia de la ligadura (no mostrado). La especificidad de los COV para los sustratos no fosforilados parecía ideal para el etiquetado del segundo adaptador después de la ligadura TACS (ver Introducción). Por lo tanto, procedimos al desarrollo de un nuevo protocolo de preparación de la biblioteca.

Como los COV mostraron un etiquetado de adaptador eficiente del ADNbc no fosforilado en 5' y no reaccionaron con el ADN fosforilado en 5' (Fig. 2B), consideramos que los COV podrían realizar un etiquetado de segundo adaptador eficiente sin la formación de dímero de adaptador. Cuando se utilizaron 83 ng (5 pmol) de 50 unidades aleatorias (N50) como objetivo modelo, el rendimiento de la biblioteca con dos secuencias adaptadoras adjuntas fue bajo con el esquema TACS-T4 (Fig. 3A, carril 4, estrella verde). . Por el contrario, se observó un rendimiento de biblioteca drásticamente mejorado con el esquema TACS-TOPO (Fig. 3B, carril 4, estrella verde). Además, las bibliotecas amplificadas por PCR preparadas usando TACS-T4 contenían una gran cantidad de dímero adaptador, mientras que solo se observó una biblioteca de inserción positiva con el esquema TACS-TOPO (Fig. 3C). Estos resultados indicaron que el esquema TACS-TOPO es superior al esquema TACS-T4 en cuanto a altos rendimientos de biblioteca y baja formación de dímero adaptador.

Comparación de esquemas de preparación de bibliotecas a partir de ADN monocatenario. (A,B) TACS-T4 (A) y TACS-TOPO (B). Se muestran el esquema (izquierda) y el análisis de ADN en cada paso de reacción con electroforesis en gel desnaturalizante (derecha). Los números en cursiva indican la longitud del ADN utilizado. Las estrellas de colores en el esquema de la izquierda corresponden a las bandas en las imágenes del gel de la derecha. Los carriles están etiquetados de la siguiente manera: (1) antes de la ligadura TACS; (2) después de la ligadura TACS; (3) después de la síntesis de la cadena complementaria con la ADN polimerasa Taq; (4) después del etiquetado del segundo adaptador; y (5) después de la purificación SPRI. (C) Una imagen de gel que muestra el análisis de bibliotecas amplificadas por PCR. Los fragmentos de ADN amplificados a partir de bibliotecas preparadas usando TACS-T4 (carriles 1 y 2: duplicados técnicos) y TACS-TOPO (carriles 3 y 4: duplicados técnicos) se cargaron en un gel desnaturalizante. Para ambas bibliotecas, se realizaron 20 ciclos de amplificaciones por PCR. Los dímeros adaptadores sólo fueron evidentes en las bibliotecas preparadas con TACS-T4. Las imágenes del gel originales se proporcionan en la Figura complementaria S7.

A continuación, investigamos la sensibilidad de la preparación de la biblioteca sin dímeros adaptadores utilizando el esquema TACS-TOPO. En este experimento, utilizamos nuevamente N50 como modelo e investigamos la aparición de dímeros adaptadores (ver. 1, Fig. 4A, B y Figura complementaria S2A). Como se muestra en la Fig. 4C, se observaron cantidades no despreciables de dímeros adaptadores cuando el ADN de entrada se redujo a menos de 24 ng. La imperfección de la 5′-fosforilación del adaptador utilizado en la ligadura TACS podría explicar este fenómeno, ya que observamos una formación reducida de dímero adaptador al usar un oligonucleótido adaptador con un grado de purificación más alto (ver. 2, Fig. 4B y Figura complementaria S2A y S2C). ). Sin embargo, como una mayor purificación del adaptador no pudo mejorar la formación de dímeros (no se muestra), necesitábamos combinar otros principios experimentales para reducir los dímeros del adaptador. El primero fue usar un adaptador más corto para eliminar los dímeros de manera más eficiente (ver. 3, Fig. 4B, Figura complementaria S2A y S2D). El otro fue agregar un residuo de uracilo cerca del lado 5' del adaptador utilizado para la ligadura TACS para degradar el dímero antes de amplificar la biblioteca mediante PCR (ver. 4, Fig. 4B, D y Figura complementaria S2A, E). Combinados con el esquema TACS-TOPO, estos dos enfoques dieron como resultado preparaciones de bibliotecas sin dímeros a partir de 24 pg de N50 (Fig. 4E y Figura complementaria S2E, G), correspondientes a la cantidad de ADN de cuatro células humanas. Por lo tanto, la preparación de bibliotecas sin dímeros adaptadores a partir de pequeñas cantidades de ssDNA se ha vuelto práctica utilizando TACS-TOPO ver. 4.

Mejoras al esquema TACS-TOPO. (A) El esquema TACS-TOPO. (B) Mejoras aplicadas a diferentes versiones del protocolo. OPC: grado de purificación de oligonucleótidos, HPLC: grado de purificación de cromatografía líquida de alta resolución. (C) La primera versión (ver. 1) produjo varios dímeros adaptadores. (D) El esquema de degradación del dímero adaptador introducido en la versión. 4 protocolo. El residuo de uracilo en el adaptador se degrada usando UDG y APE 1 antes de la amplificación por PCR de la biblioteca. Este tratamiento provoca la degradación del dímero adaptador. (E) Preparación de la biblioteca utilizando TACS-TOPO ver. 4 protocolo. Se mejoró la sensibilidad de la preparación de bibliotecas sin dímeros para realizar preparaciones de bibliotecas altamente sensibles a partir de ssDNA. Las imágenes de gel originales para C y E se proporcionan en la Figura complementaria S8.

Anteriormente, identificamos varios ADNcf monocatenarios de 50 nucleótidos de longitud en la fracción libre de células de la sangre periférica humana y los llamamos C3D10. Aplicamos el esquema TACS-T4 para analizar cfDNA y descubrimos que C3D comprende una nueva clase de cfDNA. Sin embargo, la amplificación dominada del dímero adaptador utilizando el esquema TACS-T4 requirió una eliminación laboriosa de la molécula del dímero repitiendo los pasos de purificación SPRI10. Debido a que el esquema TACS-TOPO optimizado es eficaz para la preparación de bibliotecas sin dímeros a partir de una cantidad limitada de ssDNA (Fig. 4E), aplicamos TACS-TOPO ver. 4 para la preparación de bibliotecas a partir de cfDNA. Para este análisis, utilizamos como modelo un suero humano combinado, que se obtuvo de una fuente comercial (Tabla complementaria S2, entrada número 1). Como se muestra en la Fig. 5A, las bibliotecas de secuenciación se prepararon sin formación de dímero adaptador utilizando TACS-TOPO ver. 4.

Preparación de biblioteca de secuenciación a partir de cfDNA. (A) Comparación de bibliotecas preparadas con TACS-T4 y TACS-TOPO. (B) Rendimientos de la biblioteca de TACS-TOPO ver. Se muestran 4 de varios volúmenes de suero. Las zonas separadas con líneas horizontales indican la magnitud de amplificación necesaria para la secuenciación para obtener lecturas de 90 Gb. (C) Imagen de gel que muestra el análisis de bibliotecas de ADNcf amplificadas preparadas con TACS-TOPO ver. 4. Después de la electroforesis en gel desnaturalizante en un gel al 6%, se fotografió el gel teñido con oro SYBR. (D) Distribución de tamaño de las lecturas asignadas al genoma de referencia humano. Una biblioteca preparada a partir de 50 µL de suero usando TACS-TOPO ver. 4 fue secuenciado y mapeado en el genoma humano de referencia. (E) Colocalización de lecturas mapeadas en picos G4-seq y motivos G4. A partir de las lecturas mapeadas, se seleccionaron y analizaron fragmentos de 35 a 75 nt para determinar su colocalización con los picos G4-seq y los motivos G4. Se utilizó el mismo suero (n.° 1 en la tabla complementaria S2) para (A – E). (F – H) Se muestran bibliotecas de secuenciación preparadas a partir de 50 µl de suero o plasma obtenidos de varias fuentes (Tabla complementaria S2). Se muestran los rendimientos de la biblioteca (F) y las imágenes de electroforesis en gel de las bibliotecas amplificadas para el kit ThruPlex DNA seq (G) y TACS-TOPO ver. 4 (H). El 6% de TBE-Urea en la parte inferior de la imagen del gel indica un análisis en electroforesis en gel desnaturalizante usando gel Novex TBE-Urea al 6% (Thermofisher Scientific), y el 2% de E-Gel Ex es indicativo de un análisis en E-Gel Ex (2 %) (Thermofisher científico). Las imágenes de gel originales para A, C, G y H se proporcionan en la Figura complementaria S9.

Por el contrario, se observó una alta tasa de formación de dímero adaptador con TACS-T4 incluso después de realizar una purificación basada en SPRI para la eliminación del dímero (Fig. 5A). La aparición de dos picos principales previamente identificados correspondientes a cfDNA del tamaño de un nucleosoma (ADN protegido por nucleosoma, o NPD; inserciones de alrededor de 160 nt de largo) y C3D en las bibliotecas amplificadas por PCR respaldaron la viabilidad de TACS-TOPO ver. 4 para el análisis de cfDNA (Fig. 5A). Descubrimos que el ADNcf extraído de 50 µl de suero era suficiente para la preparación de bibliotecas de secuenciación sin amplificación y que las bibliotecas de secuenciación se podían preparar con éxito a partir de 6,25 µl de suero con tres ciclos de PCR (amplificación ocho veces mayor, Fig. 5B, C). Estos resultados indican que TACS-TOPO mejoró en gran medida la sensibilidad del análisis de ADNcf porque TACS-T4 requirió al menos 250 µL de plasma o suero y 10 ciclos de amplificación por PCR10. Secuenciamos la biblioteca TACS-TOPO preparada a partir de 50 µL de suero humano para encontrar dos picos principales en la distribución de tamaños de las alineaciones de lectura mapeadas (Fig. 5D).

C3D se definió como fragmentos de ADN libre de entre 35 y 75 nt de longitud. Se sabe que las lecturas mapeadas de C3D forman picos agudos, una característica representativa de C3D (Figura complementaria S3)10. Los picos C3D se colocalizan con varias características genómicas, y el antisentido de las estructuras G-quadruplex (G4) se colocaliza mejor con los picos C3D10. Por lo tanto, investigamos si los picos de C3D llamados con las lecturas obtenidas con TACS-TOPO ver. 4 colocalizados con las estructuras G4. Los picos de C3D estaban bien colocalizados con las hebras antisentido de los motivos G4 y los picos de G4-seq (Fig. 5E y Figura complementaria S3). Estos resultados indican que TACS-TOPO puede capturar las características previamente conocidas en el análisis de cfDNA.

Para comparar las diferencias entre TACS-TOPO ver. 4 con un protocolo de preparación de biblioteca convencional adaptado a dsDNA, investigamos los rendimientos y la distribución del tamaño de las bibliotecas de secuenciación preparadas a partir del cfDNA sanguíneo extraído de plasmas y sueros de individuos sanos (para más detalles, consulte la Tabla complementaria S2). Para esta comparación, elegimos el kit ThruPlex DNA seq de Takara Bio, ya que es un kit estándar con excelentes rendimientos de biblioteca. Como se muestra en la Fig. 5F, el TACS-TOPO ver. 4 mostraron consistentemente rendimientos de biblioteca superiores al kit ThruPlex. Se observó una diferencia distintiva entre los dos protocolos en cuanto a la distribución del tamaño de la biblioteca amplificada; solo se observó un pico importante con el kit ThruPlex (Fig. 5G), mientras que dos picos fueron evidentes con la versión TACS-TOPO. 4 protocolo (Fig. 5H). Dado que la concentración molar de C3D en la sangre es comparable a la de NPD10, se espera que el protocolo de preparación de la biblioteca adaptado al ssDNA produzca un mayor rendimiento de la biblioteca que los protocolos convencionales específicos de dsDNA. Por lo tanto, considerando la alta eficiencia, los mayores rendimientos de la biblioteca observados con TACS-TOPO ver. 4 en comparación con los observados con ThruPlex son bastante razonables.

Debido a un avanzado estado de degradación, la mayor parte del ADN extraído de muestras antiguas está fragmentado y es monocatenario. Por lo tanto, los métodos de preparación de bibliotecas para dichas muestras deben adaptarse para ssDNA. En consecuencia, Meyer et al.5 y Gansauge et al.6,7 demostraron la utilidad de la preparación de bibliotecas adaptadas a ssDNA para ADN antiguo. Además, previamente demostramos que el esquema TACS-T4 mejoró enormemente los rendimientos de la biblioteca en comparación con los métodos establecidos por Gansauge et al.6,7 cuando se aplicó a la preparación de la biblioteca cfDNA10. Además, el esquema TACS-TOPO funcionó mejor que el esquema TACS-T4 en la preparación de la biblioteca de cfDNA (Fig. 5A). Por lo tanto, el esquema TACS-TOPO debería ser más adecuado para la preparación de bibliotecas a partir de muestras antiguas y, por lo tanto, posteriormente realizamos análisis de ADN antiguo utilizando el esquema TACS-TOPO.

Elegimos ADN extraído de huesos humanos excavados en el sitio de la cueva de Inome (Inome, Tabla complementaria S3)24 y el sitio de Shimekake (Shime y Shime-t, Tabla complementaria S3)25 como muestras modelo. Como estos sitios pertenecen a las eras Tumulus y Jomon tardía, respectivamente, y estos huesos eran de individuos que vivieron hace 1000 a 3000 años (Tabla complementaria S3) 31,32,33, se esperaba que los ADN extraídos estuvieran muy degradados y dañados. Además de la degradación, el ADN antiguo contiene grandes cantidades de residuos de citosina desaminados o uracilo. Debido a que el kit ThruPlex no es adecuado para ADN antiguo que contiene uracilo, utilizamos el kit KAPA Hyper Prep combinado con KAPA HiFi HotStart Uracil Ready Mix como protocolo de control adaptado solo para dsDNA.

Como se esperaba, los rendimientos de las bibliotecas fueron entre 5,4 y 10,7 veces mayores con la versión TACS-TOPO. 4 que con el kit KAPA Hyper Prep (Fig. 6A). El encarte de la biblioteca era más pequeño con TACS-TOPO ver. 4 (dos picos a 50 nt y 400 nt) que con el kit KAPA Hyper Prep (un pico a más de 200 pb) (Fig. 6B), y los tamaños medios de inserto determinados mediante secuenciación a pequeña escala reflejaron los patrones de distribución de las bibliotecas (Fig. 6C). Las tasas de mapeo del genoma humano de referencia fueron casi las mismas entre TACS-TOPO ver. 4 y kits KAPA Hyper Prep (Fig. 6D). Estos resultados confirmaron el alto grado de degradación de los ADN antiguos en ADN ss corto y la superioridad del protocolo de preparación de bibliotecas adaptado al ADN ss para analizar dichas muestras.

Comparación de la preparación de bibliotecas a partir de ADN antiguo utilizando TACS-TOPO y un protocolo convencional adaptado solo para dsDNA (kit KAPA Hyper Prep). (A – D) Comparaciones de los rendimientos de la biblioteca después de 12 ciclos de amplificación por PCR (A), electroforesis en gel de bibliotecas de secuencias amplificadas (B), longitud media de alineación de las lecturas secuenciadas (C) y tasas medias de mapeo de las lecturas en la referencia humana Se muestra el genoma (D). El kit KAPA Hyper Prep fue elegido como protocolo representativo por su sensibilidad superior entre los kits de preparación de bibliotecas comerciales y su tolerancia al ADN que contiene uracilo. E y F. Los patrones de mutación se dibujaron usando mapDamage28,29 para bibliotecas preparadas usando el kit KAPA Hyper Prep (E) y TACS-TOPO ver. 5 (F). Los cuatro gráficos superiores de cada biblioteca muestran la frecuencia base fuera y dentro de la lectura. El cuadro gris abierto en los gráficos corresponde a la lectura. Los gráficos inferiores son las frecuencias de sustitución de bases en posiciones relativas desde los extremos 5′-(izquierda) y 3′-(derecha) de las lecturas. Se muestran las frecuencias de C a T (rojo), G a A (azul), todas las demás sustituciones (gris) y bases recortadas suavemente (naranja). Kapa: kit KAPA Hyper Prep; versión TT. 5: TACS-TOPO versión. 5. Las imágenes de gel originales para B se proporcionan en la Figura complementaria S10.

En el ADN antiguo, los eventos de desaminación aumentan hacia los extremos de las moléculas de ADN, por lo que las frecuencias de las conversiones de C a T en lecturas secuenciadas tienden a aumentar en los extremos del ADN. Este cambio en la frecuencia de conversión es un indicador bien utilizado de ADN antiguo y se observa claramente con el kit KAPA Hyper Prep (Fig. 6E y Figura complementaria S4A, D, G). Por el contrario, con el TACS-TOPO ver. 4, observamos tales patrones de mutación solo en el lado 5' de las lecturas (Figura complementaria S4B, E, H). Nos dimos cuenta de que el tratamiento con uracilo ADN glicosidasa para degradar los dímeros adaptadores en TACS-TOPO ver. 4 provocó la desaparición de las lecturas convertidas de C a T en el extremo 3'. Por lo tanto, investigamos modificaciones alternativas que podrían sustituir el residuo de uracilo por la eliminación del dímero adaptador. Descubrimos que el dSpacer analógico del sitio AP (dSp) podría usarse para este propósito. Como se sabe que APE 1 corta la dSp, inicialmente utilizamos APE 1 antes de la amplificación por PCR. Sin embargo, por razones desconocidas, APE 1 no es necesario para reprimir la formación de dímero adaptador (no se muestra). Definimos este protocolo basado en dSp como TACS-TOPO ver. 5 (Figura complementaria S2A,F,G) y lo aplicó para analizar el ADN antiguo nuevamente.

Con la versión TACS-TOPO. 5, mejoras similares a las de TACS-TOPO ver. 4 se observaron en cuanto a rendimiento de la biblioteca (Fig. 6A), tamaños de inserción (Fig. 6B, C) y tasas de mapeo (Fig. 6D). Por el contrario, los patrones de sustitución de bases de lecturas obtenidos con TACS-TOPO ver. 5 diferían de los de TACS-TOPO ver. 4 (Figura complementaria S4B, E, H). Más cerca de los extremos de las lecturas, se observaron tasas de mutación más altas en ambos extremos de las lecturas con TACS-TOPO ver. 5 (Fig. 6F, Figura complementaria S4C, F, I). Curiosamente, se observaron patrones de mutación opuestos entre TACS-TOPO ver. 5 y el kit KAPA Hyper Prep. Con la versión TACS-TOPO. 5, las mutaciones de C a T aumentaron en ambos extremos de las lecturas (Fig. 6F, Figura complementaria S4C, F, I). Sin embargo, con el kit KAPA Hyper Prep, las mutaciones de C a T aumentaron solo en el terminal 5' de los fragmentos, mientras que se observaron mutaciones de G a A en el terminal 3' de los fragmentos (Fig. 6E, Figura complementaria S4A, D, GRAMO). Esta es una diferencia típica entre los protocolos adaptados a ssDNA y los protocolos adaptados solo para dsDNA5.

En el presente estudio, con la intención de establecer un procedimiento eficiente y sin dímeros para la preparación de bibliotecas a partir de ssDNA corto, investigamos el uso de VTopoI para el etiquetado del segundo adaptador después de la ligadura TACS. Si bien el VOC es específico del extremo 5' no fosforilado del ADN (Fig. 2) y el uso del VOC suprime efectivamente la formación de dímero adaptador, el dímero aún se observó cuando la cantidad de muestra era limitada (Fig. 4C). Por lo tanto, combinamos un adaptador que contiene uracilo y un tratamiento con UDG para la eliminación del dímero. El TACS-TOPO ver. 4 fue eficaz para la preparación de bibliotecas sin dímeros adaptadores a partir de una entrada de muestra limitada (Fig. 4D) y se aplicó con éxito a la preparación de bibliotecas a partir de ADNcf de sangre humana (Fig. 5). Como TACS-TOPO podría convertir de manera eficiente el ADN ss corto que existe en la fracción libre de células de la sangre en bibliotecas de secuenciación, las bibliotecas preparadas a partir de ADN cf de sangre mostraron composiciones diferentes de las preparadas utilizando protocolos convencionales solo adaptados para ADN ds (Fig. 5F-H). ). También demostramos que TACS-TOPO podría mejorar en gran medida los resultados de la preparación de la biblioteca de secuenciación a partir de ADN antiguo (Fig. 6A). Estos ejemplos exitosos respaldan la usabilidad práctica del esquema TACS-TOPO.

El uso de COV para el etiquetado del segundo adaptador dio como resultado un etiquetado de adaptador mejorado y una formación reducida de dímero de adaptador (Fig. 3), y el empleo de COV puede brindar beneficios prácticos adicionales. La primera es su velocidad de reacción; solo 15 minutos fueron suficientes para completar el etiquetado del segundo adaptador a temperatura ambiente (Fig. 3 y Métodos complementarios). La reacción de clonación basada en VTopoI es rápida y puede completarse en menos de 5 min21; por lo tanto, el esquema TACS-TOPO puede acortarse con una mayor optimización. Otro beneficio de VOC es su simplicidad operativa. Dado que el VOC no requiere materiales adicionales, agregar solo VOC a la reacción es suficiente para iniciar la reacción. Por lo tanto, VOC logra un tiempo de reacción corto y simplicidad operativa además de excelentes rendimientos de biblioteca y formación reducida de dímeros adaptadores. Estos beneficios mejorarían en gran medida la usabilidad práctica de la preparación de bibliotecas de secuencias a partir de ssDNA.

Aunque el uso de VOC para el etiquetado del segundo adaptador en el esquema TACS-TOPO reduce efectivamente la formación de dímeros de adaptador (Fig. 3C), aún se detectó la formación de dímeros de adaptador con una disminución del ADN de entrada (Fig. 4B). Esta observación es aparentemente paradójica porque los COV no reaccionarían con un adaptador 5′-fosforilado (Fig. 2B). Creemos que la contaminación por oligonucleótidos 5'-no fosforilados en el adaptador 5'-fosforilado causó este fenómeno porque se observó una menor formación de dímeros adaptadores con un mayor grado de purificación. En el estudio actual, la 5′-fosforilación del adaptador se unió químicamente. Dado que la reacción química y la purificación del producto son difíciles de perfeccionar, es inevitable la contaminación del ADN no fosforilado en el adaptador 5'-fosforilado. Si esta explicación es cierta, se espera una producción constante de dímero adaptador si se utiliza una cantidad fija de adaptador para el primer etiquetado del adaptador de ssDNA.

La reducción y degradación del dímero adaptador son las dos posibles soluciones para esta deficiencia. La versión TACS-TOPO. 4, que degrada el dímero adaptador con UDG, reprimió en gran medida la amplificación del dímero adaptador y realizó una preparación de biblioteca sin dímeros altamente sensible a partir de ssDNA (Fig. 4C, D). Sin embargo, la aplicación de la degradación basada en UDG a veces resulta difícil para muestras que contienen uracilo; por lo tanto, el TACS-TOPO ver. 4 no se pudo utilizar como procedimiento general para secuenciar la preparación de bibliotecas a partir de ssDNA. Por el contrario, TACS-TOPO ver. 5, que incluye un dSp en el adaptador usado con la ligadura TACS, es útil para reducir la formación de dímero del adaptador. La versión TACS-TOPO. 5 podría usarse para cualquier ssDNA pero es menos sensible que la versión TACS-TOPO. 4 con respecto a la preparación de bibliotecas sin dímeros (Figura complementaria S2). Por lo tanto, se requieren más estudios para establecer un procedimiento general y sensible para la preparación de bibliotecas sin dímeros a partir de ssDNA.

En el estudio actual, nos centramos en la preparación de bibliotecas a partir de ssDNA, especialmente de hebras cortas en la fracción libre de células de la sangre y de ADN antiguo. Debido a que el ADN objetivo es demasiado corto para separarlo del dímero adaptador mediante un procedimiento de purificación de ADN dependiente del tamaño, necesitábamos principios diferentes, como la eliminación del dímero adaptador basado en dU y dSp (es decir, protocolos versión 4 y versión 5). . Sin embargo, si el ssDNA es lo suficientemente largo como para separarse del dímero adaptador mediante fraccionamiento por tamaño, la versión. Se pueden utilizar 3 protocolos. Como se describe en Materiales y métodos, después de inmovilizar el ADN objetivo etiquetado con el adaptador en las perlas SPRI, las perlas magnéticas se lavaron con una solución que contenía 32% de PEG400 para eliminar las moléculas adaptadoras que no reaccionaron. Esta condición fue eficaz para eliminar el adaptador y el cebador que no reaccionaron, pero no el dímero del adaptador. De hecho, podríamos preparar una biblioteca de secuenciación a partir de ADNss objetivo de gran tamaño sin utilizar adaptadores que contengan uracilo o dSp y al mismo tiempo aplicar condiciones estrictas de fraccionamiento por tamaño (no se muestran). Como tal, con las opciones adecuadas, el esquema TACS-TOPO se puede utilizar para secuenciar la preparación de bibliotecas a partir de ssDNA; no sólo para mechones cortos, sino también para mechones más largos.

Todos los datos de secuencia obtenidos en este estudio se depositaron en NCBI GEO y NCBI SRA con los números de acceso GSE222918 y PRJNA921947, respectivamente.

Adey, A. et al. Construcción rápida, con pocos insumos y bajo sesgo de bibliotecas de fragmentos de escopeta mediante transposición in vitro de alta densidad. Genoma Biol. 11, R119. https://doi.org/10.1186/gb-2010-11-12-r119 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bentley, DR y cols. Secuenciación precisa del genoma humano completo mediante química terminadora reversible. Naturaleza 456, 53–59. https://doi.org/10.1038/nature07517 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shendure, J. & Ji, H. Secuenciación de ADN de próxima generación. Nat. Biotecnología. 26, 1135-1145. https://doi.org/10.1038/nbt1486 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Makarov, V. y Laliberte, J. Composiciones y métodos para la ligadura de adaptadores mejorada. Patente de Estados Unidos de América (2016).

Meyer, M. y col. Una secuencia del genoma de alta cobertura de un individuo denisovano arcaico. Ciencia 338, 222–226. https://doi.org/10.1126/science.1224344 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gansauge, MT & Meyer, M. Preparación de una biblioteca de ADN monocatenario para la secuenciación de ADN antiguo o dañado. Nat. Protocolo. 8, 737–748. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.038 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gansauge, MT y cols. Preparación de una biblioteca de ADN monocatenario a partir de ADN altamente degradado utilizando ADN ligasa T4. Ácidos nucleicos res. 45, e79. https://doi.org/10.1093/nar/gkx033 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miura, F. et al. La técnica de ligadura de ADN monocatenario altamente eficiente mejora la secuenciación con bisulfito del genoma completo con bajo nivel de entrada mediante etiquetado post-adaptador con bisulfito. Ácidos nucleicos Res 47, e85. https://doi.org/10.1093/nar/gkz435 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt, WM & Mueller, MW Cola de ribonucleótidos controlada de los extremos del ADNc (CRTC) mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal: un nuevo enfoque en el análisis de secuencias de ARNm mediado por PCR. Ácidos nucleicos res. 24, 1789-1791. https://doi.org/10.1093/nar/24.9.1789 (1996).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hisano, O., Ito, T. y Miura, F. Los ADN monocatenarios cortos con supuestas estructuras no canónicas comprenden una nueva clase de ADN libre de células plasmáticas. BMC Biol. 19, 225. https://doi.org/10.1186/s12915-021-01160-8 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shuman, S. & Moss, B. Identificación de un gen del virus vaccinia que codifica una ADN topoisomerasa de tipo I. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. 84, 7478–7482. https://doi.org/10.1073/pnas.84.21.7478 (1987).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shuman, S., Golder, M. & Moss, B. Caracterización de la ADN topoisomerasa I del virus vaccinia expresada en Escherichia coli. J. Biol. Química. 263, 16401–16407 (1988).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shuman, S. & Prescott, J. Escisión y unión específicas del ADN mediante la topoisomerasa del ADN del virus vaccinia IJ Biol. Química. 265, 17826–17836 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shuman, S. La recombinación mediada por la ADN topoisomerasa I del virus vaccinia en Escherichia coli es de secuencia específica. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 88, 10104–10108. https://doi.org/10.1073/pnas.88.22.10104 (1991).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shuman, S. Interacción específica del sitio de la topoisomerasa I del virus vaccinia con ADN dúplex. Sustrato de ADN mínimo para la escisión de hebras in vitro. J. Biol. Química. 266, 11372-11379 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shuman, S. Escisión de ADN específica del sitio por la topoisomerasa I del ADN del virus vaccinia. Papel de la secuencia de nucleótidos y la estructura secundaria del ADN. J. Biol. Química. 266, 1796–1803 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shuman, S. Dos clases de reacciones de unión de extremos de ADN catalizadas por la topoisomerasa de vaccinia IJ Biol. Química. 267, 16755–16758 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Morham, SG & Shuman, S. Unión de ADN covalente y no covalente por mutantes de la topoisomerasa de ADN de vaccinia IJ Biol. Química. 267, 15984–15992 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shuman, S. Reacciones de transferencia de cadenas de ADN catalizadas por la topoisomerasa de vaccinia IJ Biol. Química. 267, 8620–8627 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stivers, JT, Shuman, S. y Mildvan, AS Vaccinia ADN topoisomerasa I: evidencia cinética de catálisis ácido-base general y un paso conformacional. Bioquímica 33, 15449–15458. https://doi.org/10.1021/bi00255a027 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shuman, S. Nuevo enfoque para la clonación molecular y la síntesis de polinucleótidos utilizando la ADN topoisomerasa de vaccinia. J. Biol. Química. 269, 32678–32684 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yarovinsky, TO Aplicación de adaptadores activados por ADN topoisomerasa a la síntesis de ribosondas. Biotécnicas 28 (1160), 1162-1165. https://doi.org/10.2144/00286st06 (2000).

Artículo de Google Scholar

Adachi, N., Sawada, J., Yoneda, M., Kobayashi, K. & Itoh, S. Análisis de ADN mitocondrial del esqueleto humano de la fase inicial de Jomon excavado en el sitio de la cueva Yugura, Nagano, Japón. Antropol. Ciencia. 121, 137–143. https://doi.org/10.1537/ase.130313 (2013).

Artículo de Google Scholar

Kanzawa, H., Kakuda, T., Adachi, N., Shinoda, K. y Saitou, N. Análisis de ADN nuclear de huesos humanos excavados en el sitio de la cueva Inome, Izumo-shi, Shimane Pref. Toro. Nacional. Mus. Japón. Historia. 228, 329–340 (2021).

Google Académico

Tanaka, K. Esqueleto de Jomon del sitio de Shimekake, prefectura de Nagano. Antropol. Ciencia. (Ser. japonesa) 111, 69–85. https://doi.org/10.1537/asj.111.69 (2003).

Artículo de Google Scholar

Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. & Gu, J. fastp: un preprocesador FASTQ todo en uno ultrarrápido. Bioinformática 34, i884–i890. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty560 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. y Durbin, R. Alineación de lectura corta rápida y precisa con la transformada de Burrows-Wheeler. Bioinformática 25, 1754-1760. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp324 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ginolhac, A., Rasmussen, M., Gilbert, MTP, Willerslev, E. y Orlando, L. mapDamage: pruebas de patrones de daño en secuencias de ADN antiguas. Bioinformática 27, 2153–2155. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr347 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jónsson, H., Ginolhac, A., Schubert, M., Johnson, PLF y Orlando, L. mapDamage2.0: Estimaciones bayesianas aproximadas rápidas de parámetros de daño al ADN antiguo. Bioinformática 29, 1682-1684. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt193 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, C. & Shuman, S. Transferencia de cadenas de ADN catalizada por vaccinia topoisomerasa: ligadura de ADN que contiene un saliente de mononucleótido 3'. Ácidos nucleicos res. 28, 1893–1898. https://doi.org/10.1093/nar/28.9.1893 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakamoto, M. & Takigami, M. Recalibración de las edades de radiocarbono del "genoma de los yaponesios" utilizando IntCAL20 y Marine20. Toro. Nacional. Mus. Japón. Historia. 237, 173–186 (2022).

Google Académico

Kanzawa, H., Kakuda, T., Adachi, N., Shinoda, K. & Saitou, N. [Informe sobre investigación y actividad de investigación] Análisis de ADN nuclear de huesos humanos excavados en el sitio de la cueva de Inome, Izumo-shi, Shimane Pref. . Toro. Nacional. Mus. Japón. Historia. 228, 329–340 (2021).

Google Académico

Yoneda, M., Nakazawa, M., Tanaka, K. & Takahashi, Y. Producción de alimentos de bajo nivel a finales del período final de Jomon con cultivo de mijo reconstruido mediante análisis isotópico de restos humanos del sitio de Shimekake, prefectura de Nagano, Japón . J. Jpn. Arqueol. Asociación. 53, 25–40 (2021).

Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Mai Takigami por calibrar las edades de los huesos antiguos utilizados en este estudio. También queremos agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.

Este trabajo fue parcialmente financiado por un Proyecto de Apoyo a la Investigación para las Ciencias de la Vida y el Descubrimiento de Medicamentos (Base para Apoyar el Descubrimiento de Medicamentos Innovadores y la Investigación en Ciencias de la Vida (BINDS)) de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) [JP22ama121022j0001 a FM] y por KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) [JP21H00345 a FM].

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Kyushu, 3-1-1 Maidashi, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japón

Fumihito Miura, Osamu Hisano, Miki Miura, Yukiko Shibata y Takashi Ito

Departamento de Antropología, Museo Nacional de Naturaleza y Ciencia, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba, Ibaraki, 305-0005, Japón

Hideaki Kanzawa-Kiriyama

Departamento de Radiología Clínica, Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Kyushu, 3-1-1 Maidashi, Higashi-Ku, Fukuoka, 812-8582, Japón

Osamu Hisano

Departamento de Medicina Legal, Escuela Interdisciplinaria de Graduados en Medicina e Ingeniería, Universidad de Yamanashi, 1110 Shimokato, Chuo, Yamanashi, 409-3898, Japón

Noboru Adachi y Tsuneo Kakuda

Museo Nacional de Naturaleza y Ciencia, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba, Ibaraki, 305-0005, Japón

Ken-ichi Shinoda

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

FM conceptualizó el estudio, realizó experimentos, analizó datos y escribió el artículo. HK y OH analizaron los datos de secuencia. MM e YS realizaron experimentos. HK, NA, TK y KS contribuyeron al ADN antiguo. HK, OH y TI leyeron el manuscrito de forma crítica. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Fumihito Miura.

FM es inventor de una patente pendiente para TACS-TOPO y confirma que la patente no restringe las aplicaciones de investigación del método. Los restantes autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Miura, F., Kanzawa-Kiriyama, H., Hisano, O. et al. Un esquema altamente eficiente para la preparación de bibliotecas a partir de ADN monocatenario. Informe científico 13, 13913 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40890-3

Descargar cita

Recibido: 20 de febrero de 2023

Aceptado: 17 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40890-3

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.