Bioprospección de exopolisacáridos de importancia industrial

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13561 (2023) Citar este artículo

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Los exopolisacáridos de cianobacterias (EPS) son candidatos potenciales para la producción de biopolímeros sostenibles. Aunque las propiedades bioactivas y fisicoquímicas de los EPS basados ​​en cianobacterias son atractivas, su explotación comercial está limitada por los altos costos de producción. La bioprospección y caracterización de nuevas cepas productoras de EPS para condiciones industrialmente relevantes es clave para facilitar su implementación en diversas aplicaciones y campos biotecnológicos. En el presente trabajo, seleccionamos veinticinco cepas de cianobacterias portuguesas de un rango taxonómico diverso (incluidos algunos géneros estudiados por primera vez) para cultivarlas en condiciones de luz y temperatura diurnas, simulando las condiciones climáticas portuguesas, y evaluamos su rendimiento de crecimiento y proximidad. composición de macronutrientes. Los géneros Synechocystis y Cyanobium, de origen marino y de agua dulce, se destacaron como de rápido crecimiento (0,1–0,2 g L-1 día-1) con una composición de biomasa distinta. Synechocystissp. LEGE 07367 y Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970, mostraron una producción de 0,3 y 0,4 g L-1 de polisacáridos liberados (RPS). Se descubrió que se trataba de polímeros a base de glucanos con un alto peso molecular y un número menor de monosacáridos que el habitualmente informado para los EPS de cianobacterias. Además, también se confirmó la ausencia de cianotoxinas conocidas en estos dos productores de RPS. Este trabajo proporciona los pasos iniciales para el desarrollo de bioprocesos de EPS con cianobacterias en el clima portugués.

Las cianobacterias y las microalgas contribuyen de manera importante a la bioeconomía al obtener materias primas para alimentos, piensos, bioenergía, cosméticos y bioplásticos1. Además, importantes esfuerzos de investigación y desarrollo están aprovechando la producción industrial actual de estas fábricas fotoautótrofas en aplicaciones económicamente viables2. Ciertos productos, como los biopolímeros (es decir, sustancias poliméricas de origen natural), todavía están limitados por el costo y la capacidad de producción cuando se los considera para mercados a granel. Sin embargo, existen mercados de alto valor agregado, para aplicaciones particulares donde los biopolímeros de cianobacterias/microalgas pueden comercializarse con éxito debido a sus propiedades fisicoquímicas y/o bioactivas específicas3,4,5. La relevancia de estos biopolímeros en la bioeconomía puede aclamarse gracias a las mejoras tecnológicas y al descubrimiento de nuevas fábricas fotoautótrofas1. Por lo tanto, la bioprospección de condiciones industrialmente relevantes (por ejemplo, luz, temperatura) es clave para el desarrollo de bioprocesos y la reducción de costos6,7.

Las cianobacterias son una fuente prometedora de biopolímeros en forma de polisacáridos, que se encuentran intracelularmente (por ejemplo, glucógeno) o extracelularmente como exopolisacáridos (EPS)8,9,10. Los EPS son exudados ricos en polisacáridos que se adhieren al lado exterior de la pared celular. Sin embargo, también existen en el sobrenadante, no conectados a la pared celular. Aunque no se comprende completamente el origen de estos polisacáridos en el sobrenadante, la evidencia sugiere que tienen una composición de monosacáridos similar11,12,13,14. Sin embargo, estas dos fases se extraen de manera diferente y se distinguen como polisacáridos unidos a células (CPS) y polisacáridos liberados (RPS)15.

Estos biopolímeros han sido intensamente estudiados y algunos mostraron interesantes propiedades tecnofuncionales16,17,18; con propiedades bioactivas como antivirales, antiinflamatorias y cicatrizantes19,20,21, lo que los convierte en buenos candidatos para productos de alto valor añadido.

Una revisión exhaustiva de las metodologías aplicadas a la bioprospección de EPS de cianobacterias mostró características comunes: los perfiles de luz y temperatura se establecen constantes, y las cepas exploradas son predominantemente de los órdenes Nostocales y Oscilatoriales y del género Nostoc15. Estos estudios demostraron que el contenido de EPS es un rasgo específico de la cepa.

La diversidad biológica presente en las colecciones de cultivos puede ser una fuente de materia prima para la exploración de aplicaciones biotecnológicas22. La Colección de Cultivos de Biotecnología y Ecotoxicología Azul (LEGE-CC) es un biobanco de cianobacterias y microalgas. Actualmente comprende más de 700 cepas de cianobacterias no axénicas, el 80% aisladas de ambientes portugueses23.

La bioprospección en condiciones orientadas a procesos es una forma útil de determinar factores críticos del proceso y utilizarlos para descubrir recursos microbianos adaptados, al mismo tiempo, acercarse a escenarios industriales6,24. Portugal ha sido pionero en la producción y comercialización de microalgas en Europa, al tener la unidad de producción más antigua, y ahora este segmento está bien representado por varios productores industriales y artesanales25. El clima portugués tiene condiciones compatibles con las necesarias para la producción industrial de cianobacterias.

En este contexto, se han analizado cepas de cianobacterias no axénicas en condiciones industriales relevantes para determinar y caracterizar su potencial como fuente de biopolímeros de EPS y biomasa no tóxica para aplicaciones biotecnológicas. Para ello, inicialmente se evaluaron las cepas en cuanto a su productividad y contenido de proteínas cuando se cultivaron en fotobiorreactores (PBR) que simulaban la luz y las temperaturas diurnas de primavera en el centro de Portugal. Luego, se perfiló la biomasa de las cepas más productivas según estos criterios según su composición aproximada (proteínas, carbohidratos, lípidos y cenizas). Se priorizaron las cepas productoras de RPS. Se verificó la presencia de cianotoxinas mediante la detección de genes involucrados en la biosíntesis de estas toxinas conocidas mediante métodos moleculares tradicionales y se confirmó mediante ESI-LC-MS/MS. Sus polisacáridos se caracterizaron parcialmente mediante GC/MS-EI de trimetilsilil-O-glicósidos para la composición de monosacáridos y HPSEC-MALS para la estimación del peso molecular.

Una selección previa de sesenta y tres cepas de cianobacterias (datos no mostrados) permitió la selección de veinticinco cepas mediante la tinción de polisacáridos neutros utilizando una formulación de azul alcián. En la Tabla S1 del material complementario (SM) se presenta una caracterización cualitativa de estas veinticinco cepas. En general, los polisacáridos neutros estaban adheridos en su mayoría a la estructura celular, como CPS, mientras que algunos no tenían ninguna cercanía con las células de cianobacterias, pertenecientes a la fracción RPS.

La identificación de las cepas seleccionadas (SM Tabla S2) muestra una alta diversidad entre ellas, comprendiendo cinco órdenes: Chroococcales (54%), Synechococcales (25%), Nostocales (13%), Chroococcidiopsidales (4%) y Oscillatoriales (4%). . La muestra de estudio, que se muestra en la Fig. 1, comprende cianobacterias de diversos hábitats: ambiente de agua dulce (81%), origen marino (15%) y terrestre (4%).

Árbol filogenético de máxima probabilidad basado en 183 secuencias parciales del gen 16S rRNA de cianobacterias. Se utilizaron Gloeobacter violaceus PCC 7421 y G. violaceus PCC 8105 como grupo externo. Las cepas LEGE-CC utilizadas en este trabajo se indican en negrita y con un círculo negro. Los segmentos de diferentes colores representan la ubicación de la deformación en el nivel de orden siguiente26. Los valores de Bootstrap superiores al 50% se indican en los nodos.

Las cepas seleccionadas de cianobacterias se expusieron a condiciones simuladas de primavera, con un rango de temperatura de 11 a 22 °C, una intensidad de luz máxima de ~ 1200 µmol m-2 s-1 y una duración del día promedio de 14 h. Veintiuna de las veinticinco cepas pudieron prosperar en estas condiciones de cultivo, mientras que cuatro fueron excluidas por no ser capaces de duplicar su biomasa durante el cultivo de quince días: Chrocodiopsales cyanobacterium LEGE 14612, Chroococcales cyanobacterium LEGE 16638, Microcystis aeruginosa LEGE 91353, Synechococcales cyanobacterium LEGE 17617. Además, otras cinco cepas fueron excluidas del cribado debido a contaminación por microflagelados alrededor del octavo día de cultivo: Cyanobium gracile LEGE 09399, Geminocystis sp. LEGE 16574, Chroococcales cianobacteria LEGE 18573, Pegethrix sp. LEGE 18685 y Synechocystis sp. LEGE 16643. En resumen, nueve de las veinticinco cepas fueron excluidas de los siguientes pasos.

La combinación de luz solar y temperatura afectó directamente la productividad de la biomasa de las cianobacterias, como se muestra en la Fig. 2. Se pueden distinguir dos grupos virtuales: un grupo menos productivo (< 0,10 g L-1 día-1) compuesto por nueve cepas y un grupo más productivo (≥ 0,1 g L-1 día-1) formado por siete cepas. Curiosamente, el grupo más productivo está compuesto por todas las cepas marinas en estudio, pertenecientes en su mayoría a los géneros Synechocystis y Cyanobium (Synechocystis salina LEGE 000038, Synechocystis salina LEGE 00041, Synechocystis salina LEGE 06099, Cyanobium sp. LEGE 06140) y tres cepas de agua dulce (Synechocystis sp. LEGE 07367, Cyanobium sp.LEGE 15611, Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970). Entre ellas, las dos cepas de Cyanobium alcanzaron la mayor productividad de biomasa (Fig. 2).

Productividad de biomasa de cepas de cianobacterias durante el período de 15 días. La productividad de la biomasa se expresa en g L-1 día-1 ± error estándar (n = 3).

El grupo menos productivo está representado por nueve cepas de los órdenes Chroococcales (4), Synechococcales (2), Nostocales (3) y Oscilatoriales (1), concretamente Synechocystis sp. LEGE 06079, Tolypothrix sp. LEGE 11397, Desmonostoc muscorum LEGE 12446, Chroococcales cyanobacterium LEGE 17607, Altericista sp. LEGE 17690, Synechococcales cianobacteria LEGE 19969, Planktothrix sp. LEGE XX280, Nostocales cyanobacterium LEGE 18510 y Chalicogloea sp. LEGE 18580.

La Figura 3 muestra el contenido proteico de la biomasa de cianobacterias producida en la PBR, excepto Chalicogloea sp. LEGE 18580, Tolypothrix sp. LEGE 11397 y Desmonostoc muscorum LEGE 12446, por cantidad insuficiente de biomasa. En general, el contenido de proteína de la biomasa de cianobacterias varió del 20 al 40% del peso seco (PS), y hubo diferencias significativas a nivel global (prueba de Kruskal-Wallis, chi-cuadrado = 36,26; gl = 12, valor de p <0,001). La prueba post-hoc de Nemenyi encontró diferencias significativas entre la cepa LEGE 19969 (la de mayor contenido, 43% PS) y las cepas LEGE 06140 y LEGE 17690 (las dos de menor contenido, 24% y 24,7%, respectivamente).

Contenido de proteína en porcentaje del peso seco (PS) de las cepas de cianobacterias. Letras diferentes indican diferencias significativas entre cepas según la prueba post-hoc de Nemenyi. Los valores se dan como medias ± desviación estándar (n = 3).

La correlación entre la productividad de la biomasa y la proteína determinada por el coeficiente de Spearman fue negativa pero no significativa (\(\rho\) = − 0,29; S = 12.790; valor p = 0,07).

Se seleccionaron las cepas de cianobacterias más productivas (cuatro marinas y tres de agua dulce) y se llevó a cabo una composición aproximada de la biomasa completa (Fig. 4). En otros se aplicó un Escalado Multidimensional No métrico (NMDS) para detectar disimilitud entre cepas (Fig. 5), presentando un valor de tensión de 9,22 × 10–5.

Composición próxima de la biomasa de las cepas de cianobacterias más productivas (n = 3).

Gráfico del escalamiento multidimensional no métrico para la composición bioquímica de las siete cepas.

El contenido de proteína entre estas cepas marinas y de agua dulce varió desde las proporciones más altas para Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 (41% DW) y la marina Synechocystis salina LEGE 00041 (41%), mientras que el contenido más bajo se observó para Cyanobium sp. LEGE 06140 (24% PS).

El contenido relativo de lípidos fue más bajo para Cyanobium sp. LEGE 06140 (8% DW) y el más alto para Cyanobium sp. de agua dulce. LEGE 15611 (12% PS) (Fig. 4). Las cepas de Synechocystis salina (LEGE 00038, LEGE 00041 y LEGE 06099) mostraron un contenido de lípidos totales similar (11-12% DW), mientras que Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 mostró solo un 10% DW de lípidos totales.

El contenido de cenizas para las cepas marinas varió del 10,5% PS (Cyanobium sp. LEGE 06140) al 24,3% PS (Synechocystis salina LEGE 00038), mientras que entre las cepas de agua dulce, el contenido de cenizas varió del 5% (Cyanobium sp. LEGE 15611) al 6,9% PS (Chroococcales cianobacteria LEGE 19970).

El contenido de carbohidratos fue mayor para Cyanobium sp. (LEGE 06140), representando casi el 60% PS, mientras que el valor más bajo se encontró para Synechocystis salina LEGE 00041 (28,1% PS). Curiosamente, las cepas de agua dulce promediaron más carbohidratos que las marinas. Además, el Cyanobium marino sp. LEGE 06140 y Cyanobium sp. de agua dulce. LEGE 15611 mostró niveles muy similares de acumulación de carbohidratos: 57% DW y 54% DW, respectivamente. Las tres cepas de Synechocystis salina (LEGE 00038, 00041 y 06099) mostraron niveles variables de carbohidratos (28–39% PS). Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 registró proporciones casi iguales de carbohidratos y proteínas.

El análisis NMDS (Fig. 5) mostró la composición de la biomasa de Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 y Synechocystis sp. LEGE 07367 eran muy similares, con superposición en sus posiciones (Fig. 5). Estas dos cepas están asociadas con un alto contenido relativo de proteínas y lípidos (Fig. 4). Asimismo, Synechocystis salina LEGE 00041 se asoció con estos dos componentes, pero su mayor contenido de cenizas mostró un desplazamiento hacia este componente en la primera dimensión (Fig. 5). Synechocystis salina cepa LEGE 00038 se caracterizó por su contenido relativamente alto de cenizas (Fig. 4) y apareció asociada a ella (Fig. 5), Synechocystis salina LEGE 06099 mostró la proporción más equilibrada de todos los elementos, siendo la más cercana al origen ( Figura 5). Las cepas de cianobio LEGE 15611 y LEGE 06140 se asociaron con carbohidratos, ya que tenían la mayor proporción (Fig. 4).

Se construyó un Análisis de Componentes Principales (PCA) para explorar las relaciones entre la composición bioquímica de las cepas más productivas (Fig. 6). Los resultados del PC1 explican el 65,5% de la varianza total. Este componente se correlacionó negativamente con el contenido de carbohidratos y positivamente con el contenido de proteínas, lípidos y cenizas. El eje PC2 explica el 22,3% de la varianza total, en su mayoría correlacionado positivamente con lípidos y proteínas, y negativo con cenizas. El patrón más notable fue la asociación negativa entre el contenido de carbohidratos y todos los demás componentes. El PC1 mostró la caracterización de las cepas LEGE Cyanobium sp. LEGE 15611 y Cyanobium sp. LEGE 06140 mostró un mayor contenido relativo de carbohidratos con respecto a todas las demás cepas; el primero era relativamente más rico en lípidos y proteínas mientras que el segundo era más pobre en lípidos y proteínas y más rico en cenizas. Synechocystis salina LEGE 00041 estuvo más correlacionado con lípidos y proteínas. El PC2 confirmó dos grupos con patrones opuestos en cuanto a lípidos y proteínas por un lado y cenizas por el otro. Synechocystissp. LEGE 07367 y Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 fueron más ricas en proteínas y lípidos, y las cepas de Synechocystis salina (LEGE 00038 y 06099) fueron más ricas en cenizas.

PCA de componentes bioquímicos para las cepas de cianobacterias más productivas.

Los polisacáridos neutros al final del cultivo se tiñeron y microfotografiaron como se muestra en la Fig. 7. El grupo marino de microfotografías mostró una similitud entre la tinción con EPS compuesta por cepas de Synechocystis salina. Por el contrario, las cepas de Cyanobium de agua dulce mostraron una diferencia entre la conexión de las células y las fracciones de EPS. Synechocystissp. LEGE 07367 mostró una capa de mucílago rodeando sus células mientras que la de Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 mostró lo que se podía distinguir entre RPS y CPS. La producción de EPS en forma de RPS solo se detectó en dos cepas de agua dulce, Synechocystis sp. LEGE 07367 y Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970. El rendimiento volumétrico y masivo de RPS bruto fue mayor para Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970, como se muestra en la Tabla 1.

Microfotografías de EPS de cianobacterias después del cultivo de PBR teñidas con la formulación de azul alcián agrupadas por origen. La ampliación osciló entre 100 y 400 × y se adaptó al tamaño de las células para capturar el perfil principal de EPS alrededor de las células. Las letras corresponden a: (a) Synechocystis salina LEGE 00038, (b) Synechocystis salina LEGE 00041, (c) Synechocystis salina LEGE 06099, (d) Cyanobium sp. LEGE 06140, (e) Synechocystis sp. LEGE 07367 f) Cyanobium sp. LEGE 15611 y (g) Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970.

Las composiciones en monosacáridos de cianobacterias RPS de Synechocystis sp. LEGE 07367 y Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 se llevaron a cabo utilizando GC/MS-EI (SM Figura S2). El % molar de monosacáridos detectados en el RPS cianobacteriano se muestra en la Tabla 2. Ambas muestras de RPS son ricas en glucosa, lo que indica que la naturaleza de estos polisacáridos está basada en glucano, con otros azúcares neutros. La RPS de Synechocystis sp. está compuesto por cuatro monosacáridos principales: glucosa (Glc), galactosa (Gal), ramnosa (Rha) y manosa (Man), mientras que trazas (% molar < 1%) de xilosa (Xyl), fucosa (Fuc) y ribosa (Rib). fueron detectados. La RPS de la cianobacteria Chroococcales LEGE 19970 presenta de igual forma cuatro monosacáridos principales Glc, Rha, Gal y Man con trazas de Xyl y Fuc.

La distribución de Mw de los RPS se determinó mediante análisis HPLC-SEC/MALS, los experimentos se llevaron a cabo en 0,1 mol L-1 NaNO3 (SM Figura S3). Los polisacáridos se eluyeron entre 16 y 23 ml, que son el rango típico para fracciones de alto peso molecular y exhibieron distintos perfiles de elución. Efectivamente, la señal LS de Synechocystis sp. LEGE 07367 no vuelve al nivel inicial al final de la elución, lo que indica un fenómeno de cola del compuesto analizado, a diferencia del RPS de Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970. Por lo tanto, esto indica una elución no ideal, caracterizada por una elución lenta de moléculas. independientemente de su volumen hidrodinámico, que puede afectar la separación de todo el peso molecular en las muestras. Para mejorar la disolución del RPS se probaron diferentes parámetros (concentración, temperatura, alta homogeneización).

El detector de concentración (detector de índice de refracción) y el dn dc−1 utilizado (0,150) permitieron calcular las recuperaciones de las muestras en comparación con la masa original de la muestra inyectada. Recuperaciones de muestras obtenidas de Synechocystis sp. LEGE 07367 fue inferior (< 10%) que Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 (alrededor del 30%). La filtración de la muestra a través de un filtro de tamaño de poro pequeño (≤ 0,45 μm) puede provocar la pérdida de muestra en el caso de que pueda haber RPS de alto peso molecular presentes como agregados. Estas bajas recuperaciones también podrían deberse a la pérdida de material causada por la adsorción de la muestra debido a la interacción con el material de relleno de la columna, como lo sugiere la señal LS.

Un resumen de la distribución de Mw de Synechocystis sp. LEGE 07367 y Chroococcales cyanobacterium LEGE 19,970 RPS se muestran en la Tabla 3. Ambos RPS presentaron un índice de polidispersidad de la misma magnitud. El Mw promedio de la RPS de Synechocystis sp. LEGE 07367 es superior a Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 RPS. Se detectó una sutil señal UV en las fracciones RPS de ambas cianobacterias (datos no mostrados).

Se evaluaron toxinas cianobacterianas para ambas cepas productoras de RPS (Tabla 4). La detección por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó para seis genes asociados con la biosíntesis de cuatro cianotoxinas (Microcistina, Saxitoxina, Cilindrospermopsina y Anatoxina). Aunque no se detectaron genes para ambas cepas de agua dulce, el gen stx se detectó inicialmente para Synechocystis sp. LEGE 07367. La secuenciación del producto de PCR amplificado no correspondió al gen relacionado con la saxitoxina. Para concluir la ausencia de esta toxina, se realizó un análisis ESI-LC-MS/MS tanto para la biomasa como para el sobrenadante de Synechocystis sp. LEGE 07367 cultura. La solución estándar STX mostró un tiempo de retención (RT) de 3,25 min y fragmentos de masa de 282, 266, 240, 221, 204 y 144 m/z (Figura S4). La Synechocystis sp. Los extractos de células LEGE 07367 y los cromatogramas de iones totales de los medios se analizaron en la región de señal LC con RT de 2 a 10 minutos y todo el espectro de masas de disociación inducida por colisión (CID) no mostró el patrón de fragmentos esperado para STX o neosaxitoxina (Figura S4 C –F ). En conjunto, la evidencia respalda la ausencia de STX y Neosaxitoxina en las células y medios de Synechocystis sp. LEGE 07367. Por tanto, ambas cepas de agua dulce están libres de cianotoxinas conocidas.

Este estudio ha explorado una forma novedosa de bioprospección de cepas productoras de EPS sometiéndolas a condiciones industrialmente relevantes (luz y temperatura diarias).

En la Colección de Cultivos de Roscoff se llevó a cabo un estudio de selección que comprende una rica biodiversidad, explorando cinco órdenes diferentes, ampliando el conocimiento de los productores de cianobacterias RPS bajo luz y temperatura constantes. Sinechococos sp. RCC 2380 se destacó como una cepa productora de RPS que muestra una productividad justa de 4 mg L día-127. Nuestro estudio contribuyó a aumentar la diversidad taxonómica seleccionada en cinco órdenes de varios géneros. Cuando se realizan bioprospecciones de cepas productoras de EPS, los informes se han centrado sistemáticamente en el EPS como producto único28,29,30,31,32,33, mientras que algunos incluían la producción de biomasa34,35,36 y pocos parámetros bioquímicos37. Utilizar la luz y la temperatura diarias para simular el clima real es crucial para abordar la implementación industrial de estas fábricas fotoautótrofas38. Comprender qué cepas se adaptan mejor a estas condiciones puede ayudar a reducir el consumo de energía para el control del proceso. Por eso, la productividad de la biomasa es una métrica valiosa para evaluar el potencial de estas cepas. Espirulina sp. La producción de LEB-18 RPS cuando se cultivó en un tanque de canalización de 250 L mostró una productividad máxima de biomasa de 0,02 g L-1día-139. Nuestro estudio mostró productividades máximas de biomasa de alrededor de 0,2 g L-1 día-1; sin embargo, se espera que disminuyan cuando aumente el volumen de cultivo. Aprovechar otros metabolitos valiosos además del EPS puede proporcionar múltiples productos a partir de un solo cultivo y valorizar el bioproceso general. Algunos estudios han explorado el EPS y los pigmentos40,41 o la producción de bioetanol42. Nuestro estudio se ha centrado en la composición macromolecular de la biomasa, lo que proporciona una visión general del perfil bioquímico de cada cianobacteria. Cianobio sp. LEGE 06133 se ha destacado como una rica fuente de pigmentos (ficobiliproteínas y carotenoides) con una productividad de biomasa de 0,14 g L-1 día-1 en condiciones optimizadas43. Las dos cepas de Cyanobium más productivas mostraron una mayor productividad de biomasa que la cultivada en condiciones optimizadas. Las otras cepas más productivas analizadas en este trabajo pertenecen al género Synechocystis. Se ha informado que Synechocystis salina es una fuente valiosa de moléculas antioxidantes44 y polihidroxialcanoatos45, lo que los convierte en candidatos potenciales para un concepto de biorrefinería46.

La demanda de fuentes de proteínas alternativas está aumentando y las cianobacterias están en el punto de mira como una de ellas47. El presente estudio evaluó por primera vez el contenido proteico del siguiente género: Chroococcales cyanobacterium LEGE 17607, Altericista sp. LEGE 17690, Synechococcales cyanobacterium LEGE 19969, Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970, Tolypothrix sp. LEGE XX280 y Nostocales cyanobacterium LEGE 18510. Nuestras cepas estudiadas tenían un contenido de proteínas relativamente menor en comparación con otros géneros de cianobacterias bien estudiados, a saber, Anabaena (43–56% DW), Arthrospira (17–72% DW), Aphanizomenon (62% DW). ), Synechococcus (46-63% PS)48. Aunque existen diferentes metodologías rutinarias para la cuantificación de proteínas (análisis de nitrógeno, ensayos colorimétricos y suma de anhidroaminoácidos), se han demostrado inconsistencias entre los resultados obtenidos con unas u otras, por lo que las conclusiones sobre el contenido real de proteínas deben ser cautelosas48.

La cianobacteria modelo Synechocystis sp. PCC 6803 tiene un contenido de proteína informado que varía del 32 al 57% DW49, similar al encontrado para las cepas de Synechocystis (34-40% DW). El cianobio sp. LEGE 06113 se caracterizó por un bajo contenido de proteínas50, siguiendo el obtenido aquí para las cepas de Cyanobium.

Las cepas más productivas mostraron un contenido de lípidos similar. Las cianobacterias nórdicas de agua dulce cultivadas en aguas residuales sintéticas mostraron un contenido total de lípidos similar (6,7 y 23,5 % de peso seco)51. El Cyanobium sp. de agua dulce. CCIAM06 mostró un 5,5% PS de contenido de lípidos52, inferior al observado para Cyanobium sp. de agua dulce. LEGE 15611.

El diferente contenido de cenizas obtenido para las cepas marinas respecto a las de agua dulce está relacionado con la mayor concentración de sales en el medio marino.

Se cree que la acumulación de carbohidratos funciona como un sumidero de carbono procedente de la fotosíntesis siempre que se producen condiciones de agotamiento de nutrientes. Además, en condiciones de no agotamiento de nutrientes, las cianobacterias pueden estar compuestas por un bajo contenido de carbohidratos (10-30% PS)53. Nuestros resultados mostraron que 5 de 7 cianobacterias tenían un contenido de carbohidratos superior al 30% DW, mientras que las otras dos tenían niveles cercanos a este máximo virtual, lo que indica que los cultivos podrían estar al final de la fase de crecimiento en condiciones de agotamiento de nutrientes. En el presente trabajo, se encontró un % de peso seco promedio más alto de carbohidratos para las cepas de agua dulce en comparación con las cepas marinas. Sin embargo, no existe suficiente bibliografía para discutir este aspecto.

El valor de tensión del NMDS fue considerablemente bajo, lo que indica un muy buen ajuste. Probablemente esto se deba al número relativamente bajo de objetos en el análisis y dimensiones para establecer las diferencias. Como resultado, la reducción a un gráfico de disimilitud bidimensional es muy simple y sólida.

El análisis PCA mostró una correlación negativa entre el contenido de carbohidratos y proteínas. Un estudio previo sobre biomasa de cianobacterias encontró resultados similares54. La correlación negativa entre el contenido de carbohidratos y lípidos se describió para siete cepas de cianobacterias, lo que concuerda con resultados obtenidos previamente55,56. Hasta la fecha, ningún estudio ha explorado la correlación entre el contenido de lípidos y proteínas en las cianobacterias, mientras que nuestro estudio indica esta correlación positiva para ambas cepas de ambientes marinos y de agua dulce. Nuestros NMDS están de acuerdo con la correlación PCA observada.

Los niveles de carbohidratos obtenidos en este estudio corresponden a carbohidratos intracelulares y CPS ya que la cosecha de biomasa no pasó por ningún paso de lavado. Por tanto, podemos suponer que Cyanobium sp. Las cepas (LEGE 06140 y LEGE 15611) son ricas en carbohidratos intracelulares o CPS. Dependiendo de su ubicación, estos carbohidratos podrían ser materia prima para fines bioenergéticos57 o, en el caso de los CPS, para la producción de extractos para cosméticos o cosmecéuticos58.

El método de detección de EPS empleado en este trabajo se ha aplicado con frecuencia para detectar EPS de cianobacterias59,60,61. Como se observa en las microfotografías, no hay una distinción clara entre las cepas productoras de RPS y las cepas que no producen, ya que esta tinción no es específica de peso molecular. También se pueden teñir fracciones de menor tamaño; sin embargo, la metodología aplicada en este trabajo apunta a alto peso molecular. . Por lo tanto, el método de tinción entre las cepas más productivas sirvió como indicador de la arquitectura EPS que involucra a las células cianobacterianas. El metabolismo rico en cianobacterias permite el uso de diferentes fuentes de nutrientes que afectan su fisiología y rendimiento56. El uso de extracto de lodo marino en medios modificados af/2 promovió una productividad de EPS de 1,3 g L-1 día-1 en la cepa del género Cyanothece; sin embargo, no se mencionó información sobre la productividad o composición de la biomasa30. A pesar de la sorprendente productividad del EPS, se debe considerar el impacto en el uso de este recurso a gran escala.

Algunas de las cianobacterias más estudiadas para la producción de EPS se cultivaron en condiciones diazotróficas28,31,33,36. Las condiciones diazotróficas promovieron productividades de RPS más altas que las obtenidas en este estudio, específicamente para cultivos axénicos de Nostoc sp. PCC 7413 y Nostoc sp. PCC 8109 alrededor de 47 mg L-1 día-1 y 30 mg L-1 día-1, respectivamente28. La ausencia de una fuente de nitrógeno puede tener un enorme impacto económico en los costos asociados a los nutrientes; sin embargo, la sensibilidad de la enzima nitrogenasa al oxígeno es un factor que afecta la tasa de crecimiento de la biomasa de cianobacterias y debe abordarse a un nivel específico de cepa antes de considerar la explotación industrial62. Nuestro estudio examinó cianobacterias que no fijan nitrógeno de una amplia gama de órdenes de cianobacterias utilizando una versión industrial optimizada de medio f/2. Se espera que esta formulación sea competitiva en términos de costos en comparación con versiones más completas de medios de crecimiento de cianobacterias. Las productividades de RPS en el clima portugués fueron considerablemente mayores en comparación con las obtenidas de los representantes de los órdenes Nostocales, Chroococcales, Synechococcales, Oscillatoriales, Spirulinares Pleurocapsales, que se cultivaron principalmente en condiciones estables de luz y temperatura27,29,32,34,35,37,63 . Ambos RPS obtenidos están basados ​​en glucanos, de acuerdo con la composición de EPS descrita para cianobacterias64. Sin embargo, no se detectó ácido urónico, lo que representa un rasgo menos común encontrado en estos EPS9,65. Se utilizaron dos ácidos urónicos comunes (GlcA y GalA) como estándares con un límite de detección de 0,5 µg µL-1, que debería ser suficiente para detectar su presencia. Se podrían esperar ácidos urónicos menos comunes de las cianobacterias, por lo que se requieren más experimentos para confirmar la ausencia de estos ácidos de azúcar. Realizar un paso reductor previo a la derivatización con TMS, RMN 13C o cromatografía iónica sin derivatización son algunas de las técnicas a aplicar.

Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970 mostró cuatro monosacáridos principales, entre los cuales el 80% eran glucosa y ramnosa, lo que sugiere la presencia de un RPS de ramnoglucano. Se ha descrito que estos dos monosacáridos son ubicuos en las cianobacterias EPS64.

Synechocystissp. La composición de monosacáridos de LEGE 07367 ha mostrado una composición distinta en comparación con Synechocystis PCC 6803 y PCC 6714, a pesar de que la glucosa era un monosacárido importante, se identificaron un total de 11 a 12 monosacáridos y ácido urónico66. PCC 6714 RPS tuvo un contenido de glucosa más similar a Synechocystis sp. LEGE 07367RPS. Además, se demostró que el tipo salvaje de PCC 6803 tiene cantidades más equilibradas de hexosas, mientras que los mutantes derivados han mostrado cantidades crecientes de hexosas, particularmente de glucosa, que parece estar más cerca de la composición de RPS de LEGE 0736767,68. Las diferencias genéticas entre estas cepas o las condiciones de cultivo aplicadas podrían ser responsables de la variabilidad observada en la composición de monosacáridos.

El peso molecular promedio encontrado para ambas RPS se encuentra dentro de los rangos descritos para la cianobacteria EPS69. Synechocystissp. El peso molecular promedio de LEGE 07367 RPS concuerda con el peso molecular propuesto para Synechocystis sp. PCC 680370.

Se encontró una fracción de RPS más pequeña para la cianobacteria Chroococcales LEGE 19970 con un promedio de 636 kDa. La ausencia de una etapa de purificación para Synechocystis sp. LEGE 07367 RPS podría influir en el índice de polidispersidad. Los parámetros de conductividad y salinidad del RPS fueron adecuados para el análisis de monosacáridos y, por lo tanto, se obtuvo un rango estimado más amplio de peso molecular. Mota y colaboradores18 han observado que el RPS de Cyanothece CYY010 tiene una abundancia relativa diversa, mientras que la mayoría de las fracciones poliméricas oscilaban entre 50 kDa y 343,2 Da; sin embargo, el 30% de la fracción de RPS contenía polímeros de tamaño MDa. La diversidad de monosacáridos y el número de fracciones de peso molecular indican claramente la complejidad del RPS. Además, estas características estructurales encontradas pueden verse afectadas por las metodologías de extracción y los métodos analíticos aplicados9,71. Los pasos de purificación pueden ayudar a obstaculizar las estructuras de estos polisacáridos y comprender mejor qué tan relacionados están entre sí.

Los restos proteicos detectados en ambas fracciones de RPS se describen comúnmente en RPS cianobacterianos9,72.

Las cianotoxinas son responsables de impactar negativamente los ecosistemas, sin embargo, también podrían ser un producto de alto valor agregado para el mercado de estándares o aplicaciones biomédicas73. Se descubrió que algunas cepas de Synechocystis eran potentes productoras de neurotoxinas y hepatotoxinas74. Sin embargo, en la cepa Synechocystis sp. En LEGE 07367 se confirmó la ausencia de cianotoxinas, así como en la cepa Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970, lo que posiciona su interés para determinadas aplicaciones biotecnológicas. Sin duda, los exámenes orientados a procesos de cepas de cianobacterias inexploradas desempeñarán un papel en la implementación de bioprocesos basados ​​en cianobacterias para el sector biotecnológico en Portugal.

El análisis de cianobacterias utilizando la luz y la temperatura del clima portugués permitió distinguir cepas de un rico grupo taxonómico según su rendimiento, composición de biomasa, capacidad para excretar polisacáridos y producir cianotoxinas.

Dos cepas de cianobacterias libres de cianotoxinas, Synechocystis sp. LEGE 07367 y Chroococcales cyanobacterium LEGE 19970, se identificaron como de rápido crecimiento (0,14 y 0,12 g L-1 día-1, respectivamente) que producen RPS soluble rico en glucano de alto peso molecular 2910 kDa y 636 kDa, respectivamente. Su composición de biomasa rica en carbohidratos (> 42% PS) y en proteínas (> 36% PS) tiene potencial para una amplia gama de aplicaciones.

Las cepas de rápido crecimiento pero que no producen RPS [Synechocystis salina (3) y Cyanobium (2)] deben considerarse para el concepto de biorrefinería debido a su rico contenido de carbohidratos y/o proteínas, que en conjunto representaron entre el 65% y el 83% del peso seco. .

Este trabajo proporciona un punto de entrada para el futuro cultivo de cianobacterias al aire libre con luz solar natural y control de temperatura reducido. El LEGE-CC demostró su potencial como fuente de diversidad inexplorada, tras la detección de géneros potencialmente nuevos de cianobacterias, incluido un productor de RPS.

LEGE-CC proporcionó sesenta y tres cepas de cianobacterias. En este punto, las cepas se mantuvieron en condiciones de recolección de cultivo y se evaluaron mediante microscopía óptica con tinción con azul alcián para polisacáridos neutros34. Brevemente, las cepas (fase estacionaria) se mantuvieron bajo un ciclo de Luz/Oscuridad (L/D) de 12/12 h, intensidad de luz <20 µmol m-2 s-1 (luz fluorescente, Acardia), 19 °C, y se mantuvieron en un medio de cultivo dependiente de la cepa: medio Z875, medio Z8 suplementado con 25‰ de sales marinas sintéticas (sal Tropical Marin, Berlín, Alemania) y 1‰ con vitamina B1275 o BG11076. Los cultivos y las formulaciones de azul alcián se mezclaron en una proporción de 1:1. y utilizando un microscopio óptico Leica DMLB acoplado a una cámara digital Leica ICC50 HD (Leica Microsystems, Alemania), se observó la presencia de polisacáridos neutros.

Luego, las veinticinco cepas fueron adaptadas al medio industrial de Allmicroalgae, basado en el medio F/2 de Guillard77, que contiene 10 mM de nitrógeno y 12,5 mM de hierro. Los cultivos se mantuvieron a 25 °C, ciclo L/D de 18/6 h, 10–30 µmol m-2 s-1. Las cepas marinas se cultivaron en el mismo medio pero se suplementaron con agua con magnesio y NaCl para alcanzar una salinidad de 30 g L-1.

El ADN genómico se extrajo utilizando el Mini kit de ADN genómico (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante para bacterias Gram-negativas. La secuencia del gen 16S rRNA (pares de cebadores específicos disponibles en la Tabla 3 de SM) se obtuvo mediante amplificación por PCR siguiendo las mismas condiciones78. La secuenciación se realizó en GATC Biotech (Ebersberg, Alemania), y las secuencias de nucleótidos obtenidas se inspeccionaron manualmente para comprobar su calidad y se ensamblaron utilizando el software Geneious Prime 2021.2.2 (Biomatters Ltd., Auckland, Nueva Zelanda). Se verificaron las secuencias para detectar una posible formación de quimeras utilizando el software DECIPHER79 antes de cualquier análisis filogenético. Las secuencias obtenidas se insertaron en la base de datos BLASTn (Basic Local Alignment and Search Tool for Nucleotides) y se analizaron los resultados. Las secuencias asociadas con este estudio se depositaron en la base de datos GenBank con los números de acceso OR046505 a OR046517.

Se utilizó un total de 183 secuencias en el análisis final, incluidas 2 cepas de Gloeobacter violaceus como grupo externo, 159 secuencias de cianobacterias, incluidas cepas tipo y de referencia, recuperadas de GenBank (Centro Nacional de Información Biotecnológica, NCBI, Bethesda, MD, EE. UU.) y 22 secuencias de cepas LEGE-CC23. La alineación de secuencias múltiples se construyó utilizando MAFFT v7.45080,81 y las secuencias se revisaron y editaron manualmente. El mejor modelo de sustitución para análisis basados ​​en ML se eligió utilizando el software jModelTest 282 utilizando el criterio de información de Akaike. El análisis de máxima verosimilitud (ML) se llevó a cabo utilizando el modelo de sustitución GTR + G + I con 1000 réplicas de remuestreo de arranque utilizando el software IQ-TREE 283. El árbol filogenético final se editó en iTOL (Interactive Tree of Life)84 e Inkscape 1.285.

Antes del cultivo en PBR, las cepas se colocaron en un agitador orbital SHK-2013 (100 rpm) durante 7 días ALGAETRON AG230 (PSI Instruments) iluminado con un LED blanco frío a 70 µmol m-2 s-1 y 22 °C bajo 18: 6 ciclos L/D. El cultivo de PBR se llevó a cabo en sistemas ALGEM (Algenuity, Reino Unido) con un 25 % (v/v %) de inóculo, que comprende un volumen de cultivo de 0,2 l. ALGEM presenta un modelado de entorno geográfico que se puede utilizar para simular con precisión un entorno específico. La ubicación de la planta de producción de Allmicroalgae SA (39.652936 N, − 8.988986 W), se utilizó como sitio virtual de experimentación, mientras que la luz y temperatura diurna para el mes de mayo simularon la primavera. El pH se fijó en 8 y se controló según demanda mediante la inyección de una mezcla de 30% de CO2 y aire. La agitación se fijó constante a 100 rpm y no se proporcionó aireación. El cultivo se realizó durante 15 días y se tomaron muestras cada 2 o 3 días para el seguimiento del cultivo.

La recolección de biomasa se realizó por centrifugación (Herareus Megafuge 16R, Alemania) a 15000 g durante 10 minutos a 4 °C y se almacenó para su posterior análisis. Luego, el sobrenadante se sometió a una segunda etapa de centrifugación a 18.000 g durante 20 minutos a 4 °C, para eliminar la biomasa persistente y los restos celulares restantes. Posteriormente, el sobrenadante se precipitó en etanol frío a 3:1 (v/v %) y se mantuvo durante la noche a -20 °C. Se utilizó una malla y un colador para recuperar el precipitado, el cual luego se secó y almacenó.

La productividad de la biomasa se calculó a partir de la concentración de biomasa obtenida en los días dos y quince. Brevemente, la concentración de biomasa se determinó mediante mediciones en celdas secas realizadas bajo filtración suave al vacío. Se usó bicarbonato de amonio (0,5 M) para lavar los filtros de microfibra de vidrio GF/F (Whatman). Los filtros (F) fueron previamente deshidratados a 60 °C durante al menos 24 h, seguido por cámaras de sílice durante 1 h, antes (F1) y después (F2) de la retención de biomasa. El peso seco de las células correspondiente a la concentración de biomasa se obtuvo en g L-1 y se calculó según la ecuación. 1. La productividad de la biomasa se calculó según la ecuación. 2.

Se estimó el contenido de proteína para las quince cepas que crecieron en el ambiente simulado mediante análisis elemental CHN, según el procedimiento proporcionado por el fabricante, utilizando un Vario el III (Vario EL, Elemental Analyzer system, GmbH, Hanau, Alemania). El contenido final de proteína se determinó multiplicando el porcentaje de nitrógeno por 5,2286.

Sólo se estimaron los contenidos de lípidos, cenizas y carbohidratos para las cepas más productivas. El contenido de lípidos se estimó utilizando el método de Bligh & Dyer87 descrito con modificaciones menores88. Brevemente, se mezclaron muestras de cianobacterias liofilizadas (7–35 mg) con ~ 0,6 g de perlas de vidrio y se extrajeron con metanol mediante molienda de perlas usando un molino mezclador Retsch MM 400 a 30 Hz durante 3 minutos. Los tubos se centrifugaron (10.000 g) y los sobrenadantes se recogieron en nuevos viales. Los sedimentos sufrieron una segunda extracción y se combinaron ambos sobrenadantes de metanol. Se agregaron cloroformo y agua al metanol (2:1:2) y las muestras se agitaron durante 5 minutos. Posteriormente las muestras se centrifugaron (2500 g durante 10 min) para obtener un sistema bifásico y se separó el extracto lipídico (cloroformo). Un volumen conocido de los extractos se transfirió a tubos previamente pesados, se evaporó y se pesó para determinar los lípidos gravimétricamente. El contenido de cenizas se determinó quemando la biomasa liofilizada (aproximadamente 35 mg) en un horno (JP Selecta, Selhorn R9-L, Barcelona, ​​España) a 550 °C durante 6 h89. El contenido de carbohidratos se determinó por diferencia de los macronutrientes restantes.

Las muestras de RPS sin procesar se purificaron cuando fue necesario, utilizando membranas de ultrafiltración (corte de 50 kDa) mediante la unidad de filtro centrífugo AMICON Ultra-4. Brevemente, las muestras de RPS crudas se solubilizaron en agua ultrapura y se centrifugaron durante 10 minutos a 5000 rpm y temperatura ambiente. Se siguieron la conductividad y la salinidad (HANNA Instruments) para rastrear la presencia de sales. Cuando una solución de RPS al 0,2 % (p/v) mostró una conductividad baja (< 500 µS cm-2), se consideró apropiada para realizar análisis adicionales.

Se utilizó cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) por Eletrocnic Impact (EI) para determinar la composición de monosacáridos. Brevemente, se usó 1 ml de ácido trifluoroacético (TFA) 2 M para la disolución de 10 mg de RPS. La etapa de hidrólisis se realizó con un termobloque a 120 °C durante 90 min seguido de la evaporación del disolvente en una atmósfera de nitrógeno a 60 °C. El método de derivatización por trimetilsililación se realizó según lo propuesto por Pierre y colaboradores90,91. L-ramnosa (L-Rha), L-fucosa (L-Fuc), L-arabinosa (L-Ara), D-xilosa (D-Xyl), D-Manosa (L-Man), D-Galactosa (D -Gal), D-Glucosa (D-Glc), Ácido D-Glucurónico (D-GlcA), Ácido D-Galacturónico (D-GalA), D-Glucosamina (D-GlcN) y D-Galactosamina (D-GalN ) se utilizaron como estándares. Las muestras se inyectaron en un sistema Shimadzu Nexus Gas Chromatrography 2030 acoplado a un GCMS-QP2020NX (Shimadzu, Japón), equipado con una columna OPTIMA-1MS Accent (Macherey-Nagel, 30 m, 0,25 mm, 0,25 µm. El caudal de hidrógeno fue se fijó en 1,75 ml min-1 (7,8 psi). La primera rampa de temperatura se fijó en 100 °C durante 2,75 min y luego se logró un aumento hasta 200 °C a 8,4 °C min-1. La segunda rampa de temperatura se elevó hasta 215 °C durante 0,95 min a un ritmo constante. La ionización electrónica (EI, 70 eV) se realizó a 150 °C y el ion objetivo se fijó a 40–800 m/z. El tiempo de corte del disolvente se fijó en 5 min. , la relación de división fue 50:1 y la temperatura del inyector fue 250 ° C. Las proporciones molares relativas se determinaron de acuerdo con la normalización del área. Se utilizó el software MestReNova 7.1.0–9185 (Mestrelab Research, Coruña, España). utilizado para analizar los datos.

Cromatografía de exclusión por tamaño de alta presión (HPSEC) junto con tres detectores: detector de dispersión de luz láser de múltiples ángulos (MALS, Mini-DAWN TREOS II, Wyatt Technology Corp., Santa Bárbara, CA, EE. UU.), detector de índice de refracción diferencial (DRI) ( RID-10 A, Shimadzu, Duisburg, Alemania) y un detector UV-vis (SPD-20A, Shimadzu, Duisburg, Alemania) se utilizaron para determinar el peso molecular de las muestras. La línea HPSEC estaba compuesta por una precolumna SB-G y tres columnas en serie (SB-806 HQ, SB-804 HQ y SB-803 HQ). El sistema se eluyó con NaNO3 0,1 M y NaN3 2,5 mM, se filtró a través de un filtro de membrana de 47 mm y 0,02 µm (Anotop 47, Whatman, Maidstone, Inglaterra) y se desgasificó cuidadosamente. Las muestras de RPS se prepararon previamente agitando en el tampón de elución durante al menos 24 h a 60 °C y se homogeneizaron en Ultraturrax a 19.000 rpm durante 20 s. Por último, las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (Grace Altech, Maryland, EE. UU.). La inyección se realizó a través de un circuito completo de 100 µL y la elución se realizó con un caudal de 0,5 ml min-1. Los datos se evaluaron utilizando el software ASTRA 7.2.2.

La detección de cianotoxinas se realizó por métodos moleculares. El ADN genómico se obtuvo como en la sección "Extracción, amplificación (PCR) y secuenciación de ADN". Los genes mcyE, mcyA fueron seleccionados para el potencial de producción de microcistina (MC) y nodularina (NOD), sxtA, sxtG y sxtI para la saxitoxina (STX), y cyrJ, cilindrospermosina (CYN) y anaC-gen para la anatoxina (ANA) utilizando pares de cebadores específicos. disponible en SM Tabla 3.

Tanto las células como los medios se analizaron mediante ESI-LC-MS/MS para confirmar químicamente Synechocystis sp. LEGE 07.367 Toxicidad del resultado molecular positivo de Saxitoxina. Las células (pellets frescos) se recogieron después de la centrifugación, se separaron del medio (liofilizaron) y se extrajeron con algunas modificaciones92. Las células se disolvieron en 15 ml de una solución metanólica (MeOH:H2O, v/v 20:80), se sonicaron hasta lisis (hielo, 95 % de amplitud, 5 min) y se centrifugaron (5000 g, 4 °C, 2 min). . Esta extracción se repitió dos veces y todos los sobrenadantes se reunieron antes de que el metanol se secara por completo en rotavapor.

Tanto los extractos celulares como los medios liofilizados se resuspendieron en 200 ml de agua ultrapura (grado LC-MS) antes de someterlos a extracción en fase sólida utilizando cartuchos Supelclean ENVI-carb (250 mg, 6 ml, SUPELCO, Sigma-Aldrich, EE. UU.).

El cartucho ENVI-carb se humedeció con 6 ml de diclorometano (DCM), 6 ml de MeOH y 6 ml de agua ultrapura (grado LC-MS). Las muestras (200 ml) se cargaron a ~ 10 ml min-1 mediante un colector de vacío de 12 puertos (Waters, EE. UU.). Luego, los cartuchos se secaron con soplado bajo nitrógeno, se eluyeron con 10 ml de MeOH:DCM 60:40 (ácido fórmico al 0,5%) en tubos de ensayo de vidrio de 15 ml y se secaron al vacío con un evaporador rotatorio. Luego se reconstituyó el extracto final con 500 µl de H2O:MeOH 10:90 (ácido fórmico al 0,1%) y se transfirió a un vial de 1,5 ml para análisis LC-MS/MS.

Las muestras se inyectaron en un sistema HPLC Thermo Finnigan Surveyor de cromatógrafo líquido (Thermo Scientific, MA, EE. UU.), junto con un espectrómetro de masas con trampa de iones LCQ Fleet ™ de espectrometría de masas (Thermo Scientific, MA, EE. UU.). El programa utilizado para la adquisición y procesamiento de datos es XcaliburTM versión 2. La optimización de los parámetros del método Tune del espectrómetro de masas se realizó mediante inyección directa de una solución estándar de Saxitoxina (CRM-00-STX, lote 18-001, pureza del 99%, de Cifga, ES). de 1 ppm en H2O:MeOH 10:90 (ácido fórmico al 0,1%).

El espectrómetro de masas operó en modo de polaridad positiva por electropulverización usando escaneo completo (30–1500 m/z) y disociación inducida por colisión (CID) a 300 m/z y 316 m/z, correspondiente a los precursores iónicos de las moléculas de saxitoxina y neosaxitoxina.

El voltaje de pulverización se mantuvo a 7,0 kV; Temperatura capilar a 350 °C; El voltaje capilar y la lente del tubo se mantuvieron a 22 y 50 kV, respectivamente. Se utilizó nitrógeno como gas envolvente y auxiliar y energía de colisión a 35 eV.

La separación se logró en un ACE Excel C18 (50 × 2,1 mm ID, 1,7 μm, lote: v19-3430, AVANTOR ACE ®, VWR, PT) mantenido a 30 °C, con un caudal de 0,25 ml min-1. y el volumen inyectado fue de 10 μL en modo parcial de bucle. Los eluyentes utilizados fueron metanol (A) y agua (B), ambos acidificados con ácido fórmico al 0,1% (v/v). El programa de gradiente comenzó con 30% A, aumentando a 60% A en 10 min, volviendo a las condiciones iniciales en 5 min, equilibrándose más de 10 min con 30% A.

En estas condiciones, el tiempo de retención (RT) de SAX fue de 3,75 min y el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) fueron de 3 μg L-1 y 5 μg L-1, respectivamente. Se buscaron en el modo CID el ion precursor (m/z 300) y los iones del fragmento de referencia SAX con valores de m/z de 282, 266, 240, 221, 204 y 144, para validar la presencia o ausencia de la toxina.

Todos los análisis se realizaron con el software R93. La prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis se realizó con la función kruskal.test del paquete stats, y la prueba post-hoc de Nemenyi, con la función kwAllPairsNemenyiTest del paquete PMCMRplus. Se realizó análisis de varianza multivariado (MANOVA) con la función manova del paquete stats y prueba multivariada de Shapiro-Wilks con la función mvShapiro.Test, del paquete mvShapirotTest. El coeficiente de correlación de Spearman se calculó con la función cor del paquete de estadísticas. El escalado multidimensional no métrico, que emplea la distancia de Bray-Curtis, se realizó con la función metaMDS, del paquete vegano. El PCA se realizó con la función PCA del paquete FactoMineR.

El número de acceso de las secuencias genéticas se depositó en GENBANK y está disponible en material complementario: Tabla S2. Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Esta investigación fue financiada por FCT UIDB/04423/2020 y UIDP/04423/2020 y por el Proyecto Atlantic Interreg Mejorar MicroAlgae—Oportunidades industriales de alto valor agregado para microalgas en el Área Atlántica [EAPA_338/2016].

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Inês B. Maia

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JDC concibió, diseñó y realizó los experimentos; preparó las figuras/tablas y escribió el manuscrito. HP, GP, JM, EP, JA, RE, IM, realizaron experimentos, prepararon las figuras/tablas y contribuyeron al manuscrito. ABF, preparó las figuras/tablas y realizó el análisis estadístico. CD, JS, PD, PM, VV, concibieron y diseñaron los experimentos, redactaron el artículo y contribuyeron a la financiación.

Correspondencia a Vítor Vasconcelos.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Cruz, JD, Delattre, C., Felpeto, AB et al. Bioprospección de cianobacterias productoras de exopolisacáridos de importancia industrial en el clima simulado portugués. Representante científico 13, 13561 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40542-6

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Recibido: 16 de marzo de 2023

Aceptado: 12 de agosto de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40542-6

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